Lensfree On-чип томографический микроскопии Используя Multi-угол освещения и Pixel супер-разрешение
16 августа 2012 г.
Lensfree оптической томографии является трехмерной микроскопии, которая предлагает пространственное разрешение <1 мкм х <1 мкм × <3 мкм х, у, г размеры, соответственно, на больших изображений, объемом 15-100 мм 3, Которая может быть особенно полезно для интеграции с лаборатория-на-чипе платформ.
Общая цель данной процедуры — обеспечить безлинзовую трехмерную визуализацию биологического образца непосредственно на чипе в большом объеме сканирования. Это достигается путем размещения образца непосредственно на чипе сенсора и обеспечения частично когерентного освещения. На втором этапе источник света последовательно смещается в разных латеральных положениях для записи данных.
Голографические изображения образца со сдвигом на субпиксели. Далее следуют изображения со сдвигом на следующие субпиксели. Голографические изображения регистрируются при кратных изменениях освещения для томографической визуализации.
Заключительным этапом является обработка данных, в ходе которой полученный набор данных реконструируется цифровым способом для получения трехмерных томографических изображений образца. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими, такими как традиционная световая микроскопия, является обеспечение высокой пропускной способности визуализации в компактной архитектуре. Это делает нашу платформу особенно полезной для интеграции с платформами лабораторных чипов.
В данном отчете описывается базовая схема визуализации для настольной установки, предназначенной для томографии статических образцов. Монохроматор с ксеноновой лампой был настроен так, чтобы обеспечить выходной сигнал со спектральной шириной примерно от 1 до 10 нанометров вокруг центральной длины волны от 450 до 650 нанометров. Этот частично когерентный выход затем соединяется с многомодовым оптическим волокном для подачи частично когерентного света в систему.
Оптическое волокно установлено на моторизованном поворотном столике для изменения угла освещения. Моторизованный столик с прикрепленным источником света установлен на двухмерном линейном XY-столике, который используется для осуществления смещений источника света в плоскости при заданном угле детектирования. Используется массив CMOS-сенсоров с разрешением пять мегапикселей и размером пикселя 2,2 микрон.
Детектор используется для регистрации голографических изображений образцов с широким полем зрения. Крайне важно, чтобы массив сенсоров располагался в той же осевой плоскости, что и ось вращения источника света, чтобы убедиться в получении сенсором достаточного количества света при больших углах освещения. Хотя беслинзовая оптическая томография позволяет получать изображения различных объектов, таких как клетки и микроорганизмы, основные принципы здесь демонстрируются путем выполнения трехмерной микроскопии образца морской тихоходки с использованием скальпеля или шпателя.
Возьмите небольшой кусочек AGA из чашки Петри с культурой органов-уплотнителей. Кубический фрагмент размером в несколько миллиметров по каждому измерению будет содержать сотни нематод. Поместите небольшой кусочек агара в полипропиленовый флакон, содержащий 1 mL деионизированной воды.
Осторожно перемешайте на вортексе от 30 секунд до одной минуты. Через 10–15 минут червь должен выползти из агара в деионизированную воду. Обратите внимание, что черви слишком малы, чтобы их было видно здесь; для временной иммобилизации червей используйте один миллилитр 5–10 мМ Lima.
Добавьте раствор и подождите 10 минут. Отберите пипеткой от 5 до 10 µL образца со дна флакона и поместите его между двумя покровными стеклами. Этот образец, содержащий большое количество временно иммобилизованных червей, можно поместить на детектор для начала сбора данных.
В демонстрационных целях в данном разделе кратко описаны этапы получения изображений для типичного эксперимента по безлинзовой оптической томографии (LOT), однако весь процесс был автоматизирован с помощью специально разработанного интерфейса LabVIEW. Для выполнения действий вручную установите начальный угол поворотного столика на -50°, где 0° соответствует вертикальному положению источника света. Установите начальное положение XY-столика на 0,0, что является исходным положением.
Отрегулируйте время экспозиции детектора для оптимального использования его динамического диапазона, чтобы изображение было максимально ярким, но без насыщенных пикселей, не изменяя угол поворота поворотного столика. Сделайте девять снимков для каждого изображения. Переместите XY-столик в новую позицию по квадратной сетке 3x3 таким образом, чтобы каждое изображение смещалось примерно на одну четверть пикселя по сравнению с предыдущим.
Сбор большего количества изображений под каждым углом может улучшить разрешение в зависимости от типа объекта и соотношения сигнал/шум. После получения девяти изображений под начальным углом верните XY-столик в исходное положение (0,0). Затем увеличивайте угол поворота поворотного столика с шагом в два градуса, пока не достигнете значения +50 градусов.
После каждого приращения под каждым новым углом повторяйте описанные действия. Шаг изменения угла может быть более мелким или крупным в зависимости от оптимизации времени сбора данных относительно разрешения изображения. По завершении сбора данных получается набор из 459 изображений, который содержит девять изображений со смещением субпикселей для каждого из 51 различного угла освещения.
Каждый набор из девяти изображений подвергается цифровой обработке с использованием алгоритмов суперразрешения пикселей для получения одной проекции с высоким разрешением. Затем результаты суперразрешения пикселей голограммы для каждого угла подвергаются цифровой реконструкции для получения 51 проекционного изображения. Процесс обработки данных продемонстрирован здесь с использованием ноутбука.
Реконструкция всего поля зрения с использованием графических процессоров занимает менее одной секунды. Затем этот набор из 51 проекционного изображения подвергается обратной проекции с помощью плагина Tom OJA. Для ImageJ проекционные изображения сначала загружаются в ImageJ, после чего вызывается плагин Tom OJ.
В OJ загружается таблица поиска, содержащая данные об угле обзора для каждого проекционного изображения. С помощью метода взвешенной обратной проекции можно получить трехмерные томографические изображения образца. Большое поле зрения беслинзовой оптической томографии демонстрируется здесь тем, что образец помещается непосредственно на поверхность матрицы детекторов. Голографические изображения объектов могут быть записаны в поле зрения 24 мм², которое может быть дополнительно увеличено при использовании новых матриц детекторов с большей активной площадью.
Хотя размер пикселя матрицы детектора ограничивает разрешение регистрируемых голографических изображений, методы суперразрешения по пикселям позволяют смягчить эту проблему. Здесь представлены голограммы с суперразрешением по пикселям, а также реконструированные проекционные изображения, обеспечивающие субмикрометное пространственное разрешение для трех различных углов освещения. Проекционные изображения могут быть объединены с использованием методов томографической реконструкции для вычисления томограмм образца. Здесь показаны три среза в плоскости XY через переднюю часть червя, где глоточная трубка видна только на срезе при Z = 8 мкм, что ожидаемо для этой примерно цилиндрической структуры с внешним диаметром около 5 мкм.
Более того, поперечное изображение в плоскости XZ четко показывает границы червя и глоточной трубки внутри, что подтверждает успешное трехмерное изображение глотки. С развитием данного метода эта технология может открыть исследователям путь к проведению трехмерной микроскопии трубчатых структур объемом визуализации в десятки миллиметров. Таким образом, безлинзовая оптическая томография может стать полезным инструментом для высокопроизводительной визуализации на платформах «лаборатория на чипе».
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье рассматривается безлинзовая оптическая томография — метод трехмерной микроскопии, позволяющий получать изображения биологических образцов с высоким разрешением. Этот метод обеспечивает визуализацию больших объемов, что делает его подходящим для интеграции с платформами «лаборатория на чипе».
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биологическая визуализация
- Методы микроскопии
Теоретические сведения
- Беслинзовая оптическая томография обеспечивает пространственное разрешение <1 μm × <1 μm × <3 μm.
- Данный метод позволяет визуализировать объемы от 15-100 mm³.
- Он особенно полезен для применения в технологиях «лаборатория на чипе».
- В этом методе для визуализации используется частично когерентное освещение.
Цель исследования
- Осуществить безлинзовую трехмерную визуализацию биологических образцов.
- Изучить возможность интеграции данного метода с платформами типа «лаборатория на чипе».
- Расширить возможности визуализации объектов больших объемов.
Используемые методы
- Размещение образца непосредственно на чипе сенсора.
- Использование частично когерентного освещения.
- Боковое смещение источника света для записи голографических изображений с субпиксельным сдвигом.
- Запись нескольких голографических изображений для томографической визуализации.
Основные результаты
- Успешная трехмерная визуализация биологических образцов.
- Демонстрация возможностей высокого пространственного разрешения.
- Эффективная интеграция с платформами «лаборатория на чипе».
- Валидация метода с помощью различных тестов по визуализации.
Выводы
- Безлинзовая оптическая томография является перспективным методом биологической визуализации.
- Данный метод обеспечивает значительные преимущества в пространственном разрешении и объеме визуализации.
- В будущем область применения этого метода может расшириться на различные сферы биологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Безлинзовая томографическая микроскопия на чипе позволяет осуществлять высокопроизводительную безмаркерную 3D-визуализацию биологических образцов в больших объемах без использования громоздкой оптики, что способствует интеграции с микрофлюидными платформами и системами «лаборатория на чипе». Данный подход уменьшает габариты и стоимость прибора при сохранении субмикронного разрешения, устраняя узкие места на этапе поиска новых мишеней, связанные с пропускной способностью образцов и совместимостью анализов. Технология повышает достоверность прогнозов при ранней валидации мишеней, предоставляя количественные структурные данные с разрешением по глубине для фенотипического скрининга и снижения рисков при изучении механизмов действия.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с помощью трехмерной структурной визуализации клеточных фенотипов и субклеточных органелл.
- Практическая ценность: обеспечивает безмаркерную визуализацию живых образцов, что снижает количество артефактов подготовки и сохраняет естественные биологические свойства для исследований взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: позволяет получать количественные волюметрические данные для уточнения механизма действия и снижения рисков, связанных с путями передачи сигнала мишени, на ранних этапах поиска.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает 3D-визуализацию с субмикронным разрешением в широких полях зрения, что позволяет проводить высококонтентный фенотипический скрининг микроорганизмов и популяций клеток.
- Операционная ценность: устраняет необходимость в использовании линз и сложной оптики, стандартизируя рабочие процессы визуализации для создания воспроизводимых и масштабируемых методов анализа.
- Готовность к анализу: облегчает подготовку валидированных биологических систем для последующей оценки соединений за счет автоматизированного высокопроизводительного сбора данных.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между этапами открытия и доклинической валидации за счет применения согласованной 3D-визуализации в различных модельных системах, таких как *C. elegans* и эмбрионы zebrafish.
- Снижение механистических рисков: позволяет осуществлять лонгитюдное отслеживание структурных изменений в системах, релевантных для конкретного заболевания, что способствует согласованию биомаркеров и принятию обоснованных решений о продвижении разработки с учетом рисков.
- Достоверность доклинических моделей: сохраняет естественную архитектуру и динамику тканей, повышая трансляционную значимость результатов при переходе от условий in vitro к условиям in vivo.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс исследований — от ранних этапов биологических изысканий до идентификации ведущих соединений, обеспечивая проверку гипотез, стандартизацию анализов и количественный анализ без необходимости в трудоемкой подготовке или маркировке образцов.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы и уточнять сигнальные пути с помощью 3D-визуализации структурных фенотипов в невозмущенных биологических системах.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимую визуализацию, готовую к анализу, с количественными данными для сравнения контрольных и опытных условий в больших популяциях образцов.
- Аналитика: позволяет получать томографические реконструкции с разрешением по глубине и проекционные изображения, которые облегчают статистическое сравнение морфологических признаков.
- Трансляционные исследования: поддерживают преемственность доклинических этапов за счет визуализации релевантных модельных организмов с постоянным разрешением и объемом охвата.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многоразовая платформа визуализации, совместимая с различными типами образцов и микрофлюидными форматами, что снижает затраты на избыточные технологические инвестиции.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет безмаркерной 3D-визуализации высокого разрешения, которая снижает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость благодаря безлинзовой конструкции, автоматизированному сбору данных и совместимости с сенсорными матрицами большого формата.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления фенотипических аномалий, что снижает биологические риски на поздних этапах и неэффективность использования капитала.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя количественные многопараметрические данные визуализации для объективного сравнения терапевтических кандидатов.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области вычислительной визуализации, голографии и алгоритмов томографической реконструкции.
- Метод зависит от использования КМОП-сенсорных матриц высокого разрешения и моторизованных систем освещения для многоракурсного сбора данных.
- Для обеспечения воспроизводимости необходима межгрупповая стандартизация протоколов освещения, настроек экспозиции и процедур субпиксельного сдвига.
- Адаптация метода для различных модельных систем может потребовать оптимизации способов подготовки и иммобилизации образцов для сохранения их жизнеспособности во время визуализации.
- Практические ограничения включают чувствительность к показателю преломления и рассеивающим свойствам образца, что может повлиять на отношение сигнал/шум в плотных или сильно поглощающих объектах.
