В пробирке Ко-инфекция моделью для изучения Plasmodium тропической ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Мы разработали

Общей целью данной процедуры является разработка in vitro модели для изучения влияния эритроцитов, инфицированных Plasmodium fpar, на репликацию ВИЧ-1 в макрофагах, полученных из первичных моноцитов человека. Это достигается путем выделения сначала плазмодия, ложных параинфицированных эритроцитов, с помощью системы veac, а затем воздействия на инфицированные клетки макрофагов, полученных из моноцитов человека. Затем макрофаги, полученные из моноцитов, подвергающиеся воздействию эритроцитов, инфицируются полностью репликативным ВИЧ или кодировкой люциферазы с одной репликацией, ВИЧ.

Наконец, супернатанты культуры собирают на 3, 6, 9 и 12 день после инфицирования на полностью реплицирующийся вирус для вируса, кодирующего люциферазу. Инфицированные клетки остаются в организме через 72 часа после заражения. В конечном счете, репликацию вируса можно контролировать путем количественного определения количества белка одного капсида ВИЧ P 24 в надосадочной жидкости по методу Элизы, а вирусную транскрипцию можно контролировать путем количественного определения люциферазы клеточных лизатов.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области малярии, сочетанных инфекций ВИЧ. Например, как заражение паразитом plasmodium влияет на репликацию ВИЧ? Хотя этот метод был разработан для изучения взаимодействий между плазмодием и ВИЧ-5 в макрофагах, он также может быть применен к другим типам клеток.

Например, дендритные клетки, моноциты или CD четыре Т-клетки, демонстрирующие процедуру, будут Гваделупе Андреани. Постдокторант в лаборатории Начните с забора эритроцитов из культурального планшета, промойте восстановленные клетки в 10 миллилитрах моноцитарной макрофагальной среды, а затем повторно суспендируйте гранулу в 12 миллилитрах моноцитарной культуры макрофагов Medium. Теперь медленно добавьте клеточную суспензию в колонку Milton ECS и дайте ей протечь, промыв колонку свежей средой один раз, снимите ее с магнита и промойте 12 миллилитров культуры макрофагов, полученных из моноцитов.

Среда через колонку, ускользая от инфицированных эритроцитов в стерильной пробирке, чтобы подвергнуть моноцитарные макрофаги инфицированным или неинфицированным эритроцитам. Добавьте соответствующий объем суспензии эритроцитов в каждую лунку ранее подготовленного 24-луночного планшета, содержащего макрофаги, полученные из моноцитов. Инкубируйте сокультуры при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе через четыре часа, удалите среду, содержащую эритроциты, а затем осторожно добавьте 600 микролитров PBS без эндотоксинов в каждую, хорошо трижды отсасывая PBS сразу после каждой промывки.

Теперь по 200 микролитров льда, холодной, стерильной воды в каждую лунку, чтобы эритроциты всасывали воду через 20 секунд. Затем по 600 микролитров моноцитов выводят макрофаги в каждую лунку и инкубируют культуры в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе. Оценить влияние плазмодия ложного парема на ВИЧ одну репликацию в моноцитарных макрофагах при введении 300 мкл моноцитарной производной макрофагальной среды, содержащей P 24 NL, четырех трех BO IV 1 вирусов в соответствующие лунки, аналогичные протоколу, изображенному на этом рисунке.

После инкубации сокультур в течение двух часов трижды промойте клетки 600 микролитрами PBS без эндотоксинов. Затем при концентрации 600 микролитров свежую моноцитарную макрофагальную среду в каждую лунку и продолжайте инкубацию сокультур на 3, 6, 9 и 12 дни. После первичной вирусной инфекции соберите по 200 микролитров каждого сната, заменяя восстановленную клеточную суспензию 200 микролитрами свежего макрофага, полученного из моноцитов. Терпимая. После этого собранные надосадочные жидкости хранят при температуре минус 20 градусов Цельсия для последующего анализа Элизой.

С целью определения влияния паразитов на ВИЧ экспрессии одного гена в моноцитарных макрофагах в 300 мкл моноцитарной макрофагальной среды, содержащей P 24 интересующего вируса, покрытого люциферазой ENC, в соответствующие лунки проводят по аналогии с проиллюстрированными здесь протоколами. После инкубации и промывки кодовых культур, как показано только что для вируса, не покрытого люциферазой ENC, удалите среду через 72 часа после заражения и добавьте 200 микролитров анализа люциферазы. Ударный буфер для лизиса теперь облизывает клетки при комнатной температуре с легким встряхиванием, а затем хранит сокультуры при температуре минус 20 градусов Цельсия.

После размораживания планшет переносят по 40 микролитров лизата из каждой лунки в соответствующую лунку в 96-луночной люминометром. Затем добавьте в каждую по 100 микролитров подложки люциферазы из набора для анализа люциферазы. Ну и, наконец, измерьте активность люциферазы светлячков с помощью люминометра.

Согласно инструкциям производителя в этом эксперименте, моноцитарные макрофаги подвергались воздействию инфицированных или неинфицированных эритроцитов, а затем заражались NL four three blen. Как только что было продемонстрировано, производство вирусного белка P 24 затем контролировалось с помощью ELIZA для ВИЧ one P 24 в бесклеточных надосадочных зонтах в различные моменты времени после первичной вирусной инфекции. Обратите внимание на значительное снижение высвобождения вирусных частиц на 12-й день, измеренное с помощью белка капсида P 24 ВИЧ в супернате моноцитарных макрофагов, предварительно обработанных паразитами.

В этом эксперименте макрофаги, полученные из моноцитов, подвергались воздействию инфицированных и неинфицированных эритроцитов, а затем инфицировались вирусом, кодируемым люциферазой, как только что продемонстрированная экспрессия люциферазы, затем оценивалась в клеточном лизате через 72 часа после первичной инфекции вируса. Моноцитарная макрофагальная инфекция с такими вирусами, несущими либо экзогенный VS. Гликопротеины VG или ВИЧ one приводили к достоверно меньшей продукции люциферазы в клетках, подвергшихся воздействию p-ложного шпата. Следует отметить, что псевдотипированные вирусы VSVG проявляли гораздо большую люциферазную активность, чем их JRFL на аналогах, из-за большей эффективности заражения псевдотипированными частицами VSPG.

Эта методика позволит исследователям в области малярии, сочетанной инфекции ВИЧ изучить взаимодействие между этими двумя патогенами в модели in vitro, которая адаптируется к изучению нескольких типов иммунных клеток.