Количественные, в режиме реального времени анализ базы активность репарации в клеточных лизатов Использование Поражение конкретные молекулярные маяки

Общая цель следующего эксперимента — измерить скорость восстановления ДНК и извлечения клеточных ядер в режиме реального времени с помощью молекулярных маяков, которые флуоресцируют после их восстановления. Молекулярные маяки базовой эксцизионной репарации состоят из дезоксиолигонуклеотидов в структуре стволовой петли, содержащей одно повреждение основания с шестью изогнутыми оксифлуоресцеиновыми фрагментами, сопряженными с пятью основными концами, и дил моти, сопряженными с тремя простыми концами при сворачивании. Шесть фам моты гасятся мазью не флуоресцентным способом за счет резонансной передачи энергии лесника.

Чтобы оценить активность репарации ДНК, маяки инкубируют с экстрактами клеточных ядер, которые содержат ферменты репарации. Гликозилат ДНК распознается и удаляется повреждение ДНК в маяке. Полученные сайты АБК являются субстратами для АР эндонуклеазы один или обезьяны При распознавании АПЭ один расщепляет остов ДНК в месте АВА, позволяя ДНК, содержащей шесть фам, свободно диссоциировать от шпильки.

Отделение от гасителя приводит к увеличению флуоресценции, пропорциональному уровню репарации ДНК и может быть оценено в режиме реального времени с помощью количественной ПЦР-машины в реальном времени. Способность восстанавливать повреждения ДНК имеет решающее значение для каждой клетки и каждого организма. Среди множества путей репарации клеточной ДНК, мишеней для эксцизионной репарации оснований, поврежденных оснований, которые могут возникнуть в результате окислительных или химических повреждений, выяснение роли отдельных клеточных элементов, которые могут влиять на эксцизионную репарацию оснований, является одной из основных целей наших лабораторных исследований.

Таким образом, точное и чувствительное измерение активности репарации ДНК стало интересом в нашей лаборатории. Этот анализ может дать такие данные. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как мечение 32 PN и анализ методом гель-электрофореза, заключается в том, что наша методика не использует радиоактивные меченые субстраты, может измерять скорость восстановления отходов в режиме реального времени и имеет очень большой динамический диапазон.

Кроме того, этот подход может использовать несколько различных флюорочетверов и/или повреждений основания для определения специфичности субстрата. Мы показали, что этот анализ является высококоличественным и очень чувствительным в различных условиях. Этот молекулярный анализ методом эксцизионной репарации оснований поддается кинетическому анализу.

Высокая чувствительность и специфичность анализа позволяют точно количественно оценить эксцизионную репарацию оснований и, следовательно, полезны для скрининга ингибиторов репарации или валидации. Кроме того, он может быть адаптирован для измерения активности восстановления дрожа, а лизаты тканей и опухолевых клеток — для измерения функциональных биомаркеров. При проектировании молекулярных маяков, которые будут использоваться для этого анализа, учитывайте следующие олигонуклеотиды ДНК длиной 43 основания, как показано здесь.

Хорошо работают. Последовательность ДНК не уникальна, но должна позволять формировать шпильчатую структуру. При стоянии на колене, как показано здесь, специфичность достигается путем введения специфических поражений оснований, таких как урацил или тетрагидрофурин.

В положении X на шести основаниях от пяти простых концов содержание GC должно составлять не менее 32%, и основание GB не должно размещаться на пяти простых концах. Шесть карбоксифлуоресцеинов или шесть фам должны быть сопряжены с пятью основными концами, а три основных конца должны быть модифицированы даб силом. Он будет субстратом для белков репарации ДНК, чтобы обеспечить связывание и активность высвобождения гликозилов

Положение поражения было выбрано таким образом, чтобы обеспечить достаточное пространство от структуры шпильки и конца ДНК. Длина стебля или шпильки дуплекса должна составлять минимум 15 пар оснований. Рекомендуемая длина петли – 13 оснований.

Контрольный молекулярный маяк должен быть идентичен экспериментальному молекулярному маяку, за исключением того, что он не содержит поражения ДНК. Поэтому он не должен распознаваться ферментами репарации ДНК. После того, как молекулярные маяки находятся в руках, следует провести оценку качества, чтобы убедиться, что они не флуоресцируют до нагрева.

А чтобы определить оптимальную температуру таяния, все действия во время процедуры экстракции следует выполнять на льду или при четырех градусах Цельсия. Чтобы обеспечить стабильность белка, подготовьтесь к эксперименту с помощью предварительного охлаждения. Два литровых стакана на образец диализные буферные диализные камеры, микроцентрифуга, пробирки, шприцы и иглы.

Наклейте этикеткой 15 миллилитровые конические трубки и положите их на лед. Отсадите питательную среду из клеток, а затем дважды промойте их 7,5 миллилитрами холодной PBS После второй промывки. Добавьте пять миллилитров холодного PBS в каждую чашку и с помощью подъемника для клеток соскребите клетки с тарелки.

Переложите клетки в охлажденную коническую пробирку объемом 15 миллилитров, затем центрифугируйте при температуре 500 раз G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После отжима удалите надосадочную жидкость и оцените объем упакованной клетки, сравнив его с известными объемами жидкости в аналогичных пробирках. Центрифугируйте пробирки еще минуту, а затем удалите остатки PBS с помощью дозатора.

Суспендируйте клеточную гранулу в 150 микролитрах реагента для экстракции ядерного оружия, по одному на каждые 50 микролитров объема упакованной клетки. Затем перенесите ресуспендированные клетки в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку и заведите их на 15 секунд с высокой скоростью. После вортекса инкубируйте пробирку на льду в течение пяти минут, затем сделайте вихрь еще 15 секунд и центрифугируйте при 13 000 перегрузках в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

После отжима удалите и выбросьте надосадочную жидкость, которая содержит цитоплазматическую фракцию. Ресуспендируйте гранулу в смеси из одного микролитра суспензии 100 x коктейля ингибиторов протеазы, одного микролитра 100 миллимолярного DTT и 75 микролитров экстракции ядерного оружия. Реагент два на 50 микролитров объема упакованной клетки.

Вихревые ячейки в течение 15 секунд на высокой скорости. Инкубируйте на льду в течение пяти минут и снова в течение 15 секунд на высокоскоростной центрифуге при 13 000 перегрузках в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После отжима с помощью шприца переносится надосадочная жидкость, содержащая ядерные белки, в диализную кассету с отсечкой по молекулярной массе 7000

Затем добавьте 500 микролитров одного моляра DTT в 500 миллилитров предварительно охлажденного диализного буфера и диализируйте лизат в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия при осторожном помешивании. Через 90 минут перенесите диализную кассету во второй стакан, содержащий 0,5 литра предварительно охлажденного диализного буфера с DTT, и диализируйте. Лизат в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия при осторожном перемешивании после диализа экстракт мог кристаллизоваться из-за высокой концентрации белка.

Затем вставьте новый шприц в порт, отличный от того, который использовался для введения кассеты, и соберите раствор диализованного ядерного белка из диализной кассеты. Старайтесь включать мутные кристаллы при удалении диализованного раствора ядерного белка. Поместите образец в микроцентрифужные пробирки по 20 микролитров каждая, быстро заморозьте на сухом льду, а затем храните его при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока он не понадобится.

Определите концентрацию белка и проведите контроль качества, как описано в сопроводительном документе. Для проведения анализа молекулярных маяков разморозить и разбавить клеточные лизаты до двух микрограммов на микролитр белка с помощью основного реакционного буфера цизионной репарации, содержащего один миллимоляр DTT, развести молекулярные маяки до 200 микромоль с помощью основного реакционного буфера эксцизионной реакции. Поскольку количественная ПЦР-машина в реальном времени обычно не используется в качестве флуориметра, измените метод работы количественной ПЦР-машины в реальном времени, чтобы собирать данные каждые 20 секунд при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 180 циклов.

Затем каждые 20 секунд в течение 15 циклов при максимальной флуоресценции молекулярного маяка для получения данных для нормализации. Установите объем реакции на 25 микролитров. Затем настройте конструкцию пластины на приборе с помощью прикладного программного обеспечения биосистемы с выбранной в качестве типа эксперимента стандартной кривой, завершите схему плана.

Пример приведен в этой таблице, с которой также можно ознакомиться в сопроводительном документе. Ничего не добавляйте к хорошо выбранной в качестве стандартной кривой. Поместите на лед основной буфер реакции эксцизионной реакции лизат клеток DTT в концентрации двух микрограммов на микролитр и все молекулярные маяки, используемые в эксперименте.

Затем добавьте DTT в буфер для реакции эксцизионной реакции до конечной концентрации в одну миллимолярную пипетку. 15 микролитров основного буфера для реакции эксцизионной реакции с DTT в каждую лунку совместимой оптической пластины Q-R-T-P-C-R на льду. Далее, следуя схеме расположения планшетов, пипеткой проведите маячки в соответствующие лунки.

Каждая комбинация лизата и молекулярного маяка или контроля должна быть проанализирована в трех экземплярах. Наконец, пипетку по пять микролитров на лунку разбавленного ядерного лизата в соответствующие лунки. Важно помнить, что все реагенты молекулярных маяков должны быть холодными, а в качестве последнего шага необходимо пипетировать лизаты в планшет.

Помните, что лизаты содержат активные белки, и они начнут восстанавливать молекулярные маяки, как только их введут в реакционную смесь. Поэтому очень важно держать все реагенты в холоде, чтобы свести к минимуму объем ремонта маяка, который происходит до начала измерений. После того, как все будет добавлено, запечатайте пластину оптической клейкой пленкой и перемешайте, слегка постукивая по пластине.

Затем выполните быстрый десятисекундный отжим центрифуги для сбора растворов на дне пробирок или планшета после отжима, вставьте планшет в количественную машину для ПЦР в реальном времени и начните анализ после завершения, экспортируйте исходные данные, желательно в формате Excel, и следуйте инструкциям в сопроводительном документе, чтобы проанализировать данные после того, как будут сделаны необходимые расчеты. Построение графика нормализованной флуоресценции в процентах свободного времени в секундах на диаграмме рассеяния с соответствующими погрешностями для оценки активности репарации ДНК и качества ядерных экстрактов из клеток LN 4 28 и клеточной линии сверхэкспрессии MPG, обозначенной как LN 4 28 MPG. Анализ, описанный в этом видео, проводился с использованием молекулярного маяка, содержащего субстрат APE one тетрафурин в качестве положительного контроля.

Как показано на этом рисунке, обе клеточные линии обладают высокой активностью APE one, о чем свидетельствует крутой наклон, активность гликозата ДНК, специфичная для удаления субстрата MPG. Гипогипоксантин, обозначенный как HX, был обнаружен в ядерных лизатах обеих клеточных линий. Каждый лизат анализировали с использованием либо базового контрольного молекулярного маяка эксцизионной репарации, либо молекулярного маяка эксцизионной репарации оснований HX для контрольного маяка LN 4 28 показано зеленым цветом, а LN 4 28 MPG - фиолетовым для гипомаяка.

LN 4 28 показан синим цветом, а LN 4 28 MPG — оранжевым. Результаты представлены как А — средние единицы флуоресценции и В — нормализованная флуоресценция. Зависящее от времени увеличение флуоресценции, указывающее на репарацию HX, произошло в каждой клетке.

Лизат инкубировался с молекулярным маяком HX, как и ожидалось. Клеточная линия LN 4 28 MPG, обозначенная оранжевым следом, имела гораздо более высокую скорость репарации, о чем свидетельствует более быстрое накопление флуоресценции, чем родительская клеточная линия LN 4 28, которая имеет минимальное количество белка MPG. Таким образом, скорость репарации специфических повреждений ДНК специфическими белками репарации может быть измерена из клеточных экстрактов в режиме реального времени с минимальными фоновыми уровнями неспецифического расщепления ДНК.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проектировать молекулярные маяки и измерять скорость восстановления ДНК в режиме реального времени с использованием очищенных белков или клеточных лизатов. Что касается анализа, важно оценить динамический диапазон и фоновые значения путем включения управляющих реакций, таких как с положительным и отрицательным контрольными маяками или без них. Учитывая изменчивость от скважины к скважине, полезно нормализовать данные в отдельных скважинах до входных значений.

Они определяются более тонкой ступенью при температуре плавления. Это, а также включение других красителей, таких как каменная матрица, объясняет изменчивость, присущую ошибкам пипетирования или различиям в детекторах. Этот метод позволил нам выяснить влияние отдельных компонентов эксцизионного ремонта на общую активность и производительность ремонта.

Он достаточно чувствителен, чтобы выявить небольшие изменения, которые не были бы обнаружены обычными методами.