On-Chip эндотелиальных Воспалительные фенотипирование

Целью данного видео является демонстрация лабораторной работы на чипе для характеристики воспалительного состояния эндотелиальных клеток. Для начала эндотелиальные клетки аорты человека выращиваются до слияния на субстрате тканевой культуры, а затем вставляются в устройство для резки пластин Конана. Клетки обрабатываются провоспалительным цитокином TNF альфа и одновременно подвергаются воздействию дифференциального напряжения сдвига в течение четырех часов путем точного контроля вращения колбочки над субстратом.

Это включает в себя повышение регуляции молекул адгезии, таких как VCA one и ICAM one. Подложка передается на столик для микроскопа, где микрофлюидное устройство A-P-D-M-S вакуумно запайывается непосредственно в монослой, создавая проточные каналы. Активированные моноцитарные клетки THP one пролетают над предварительно кондиционированными hs, где они связываются пропорционально уровню экспрессии молекулы клеточной адгезии.

Воспалительное состояние эндотелия определяется путем количественного определения общего количества клеток ТГП, которые надежно остановлены. Здравствуйте, меня зовут она D Diverse, а я Грег Фостер. А меня зовут Кит Бейли.

Мы находимся в лабораториях профессоров, пастора и Саймона на факультете биомедицинской инженерии Калифорнийского университета в Дэвисе. Сегодня мы опишем использование лабораторного подхода на основе чипа для количественного изучения эндотелиальной дисфункции и воспаления. Эти инструменты предоставляют нам платформу для проведения исследований, связанных с наложением метаболического стресса на гидродинамические факторы и регуляцией фенотипа эндотелиального воспаления и восприимчивости к атеросклерозу.

Поэтому мы называем наши устройства сосудистыми миметическими, микрофлюидными камерами или VMMC. Эти устройства позволяют количественно оценить воспалительные исходы в эндотелиальных клетках и моноцитах в условиях, имитирующих таковые в атерогенных сосудах. Добровольный обрез крайней плоти облегчает использование небольших количеств реагентов или материалов, которые могут быть в ограниченном количестве.

Они также могут быть сконструированы в ряде настраиваемых планировок и геометрий, что делает их очень подходящими для широкого спектра применений. Сегодня мы продемонстрируем репрезентативный эксперимент с использованием нашей лаборатории на чипе. Монослои эндотелия человека будут подвергаться активации цитокинов при четко определенных напряжениях сдвига.

Мы продемонстрируем использование VMC для количественной оценки рекрутирования моноцитарных клеток человека в монослой в режиме реального времени в виде функционального считывания активации эндотелия с помощью токарного станка: трехдюймовые круглые подложки фрезеруются из 100-миллиметровых тарелок для культивирования тканей. Трехдюймовые подложки промывают дистиллированной водой, а затем стерилизуют путем замачивания в 70% этаноле. Стерильные субстраты помещают в 100-миллиметровые чашки Петри и дают им высохнуть.

Затем их инкубируют с коллагеном первого типа в концентрации 100 микрограммов на миллилитр в течение одного часа при комнатной температуре и промывают PBS. Эндотелиальные клетки аорты человека или ГК суспендируются в концентрации 650 000 клеток на миллилитр. Один миллилитр клеточной суспензии помещают каплями на высушенный субстрат, покрытый коллагеном, и распределяют в равномерную суспензию.

Затем сидячие субстраты помещаются в инкубатор с температурой 5% CO2 при температуре 37 градусов и прикрепляются к поверхности субстрата. Через час после добавления девяти миллилитров E GM двух растительных сред и позволять клеткам расти в монослои с плавностью примерно 90% Co, монослои готовы к использованию для последующих экспериментов. Сосудистые миметические микрофлюидные камеры конструируются путем заливки формы A-P-D-M-S на основную форму, содержащую желаемый канал. Геометрия.

Силиконовая основа заливается в пластиковую лодочку, после чего следует силиконовый отвердитель в соотношении 10 к одному по весу. Гель PDMS затем хорошо перемешивается, стараясь не поцарапать борта пути лодки, и тем самым внести пластиковую стружку в смесь. Мастера фоторезиста очищаются гексаном и подготавливаются к формованию VMMC.

Затем смесь PDMS заливается на мастер-форму, а затем помещается в вакуумную камеру. В камере. Воздух удаляется из смеси PDMS и поднимается на поверхность через 15 минут.

Форма извлекается из камеры и осторожно обдувается воздухом над поверхностью PDMS, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха из формы. Затем форму накрывают крышкой и помещают в духовку при температуре 37 градусов на один час, где PMS дает застыть. Достаньте застывший гель PDMS из духовки и сделайте круговые надрезы вокруг камеры с помощью небольшого скальпеля.

Очень важно делать это постепенно, чтобы избежать контакта с фоторезистным материалом, так как это может повредить мастер-форму. Отрежьте микрофлюидную камеру от входного и выходного отверстий пуансона для каждого канала с помощью иглы для блокировки приманки 19 калибра. Кроме того, проделайте отверстия для вакуумных трубок вдали от каналов.

Подготовка к добровольному обрезанию крайней плоти завершилась. Пипеткой впрыскивайте провоспалительный цитокин TNF альфа в шесть миллилитров среды L 15 для достижения конечной концентрации 0,5 нанограмма на миллилитр. Фильтрующий материал L 15 используется здесь в качестве жидкости для сдвига из-за его буферной способности pH при отсутствии 5% CO2.

Затем среда набирается в стерильный шприц объемом 10 миллилитров, который используется для загрузки ножниц. Затем конфлюентный монослой передается в устройство для резки клеток, которое стерилизуется с выравниванием этанола и устанавливается высота зазора между конусами. Подложка извлекается из чашки Петри и помещается на стеклянный измерительный блок по центру и осторожно вставляется в дно камеры корпуса таким образом, чтобы конус находился непосредственно над ячейками.

Подложка фиксируется с помощью равномерно затянутых винтов из нержавеющей стали вокруг измерительного блока. Затем режущее тело загружается в камеру, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха. Затем компьютер используется для ввода желаемой программы напряжения сдвига, и включается микроотдельный двигатель.

Здесь мы используем колебательный сдвиг, равный нулю плюс-минус пять динов на квадратный сантиметр. Через четыре часа программа стрижки прекращается. Измерительный блок удаляется, и субстрат аккуратно помещается обратно в чашку Петри.

Теперь клетки готовы к анализу адгезии моноцитов. Сразу после резки монослои ГК транспортируются на станцию микроскопа для сборки ВММК. VMMC прикрепляется к вакуумному шлангу и погружается в деионизированную воду для удаления пузырьков воздуха, попавших в каналы.

Когда вакуумный клапан первоначально снят, камера осторожно нажимается на верхнюю часть монослоя и включается вакуумный клапан. Здесь очень важно убедиться, что пузырьки воздуха не попали в каналы камеры. Теперь 80 микролитров HBSS с кальцием и магнием пипетируются в резервуар, сделанный путем срезания кончика приманки 19 калибра. Жидкость иглы Lock выталкивается из наконечника путем сильного нажатия на верхнюю часть резервуара, который затем вставляется во входное отверстие VMMC.

Вся сборка помещается на предметный столик микроскопа, а камера микроскопа и видеомонитор включаются. На шприцевой насос загружается стеклянный шприц объемом 10 миллилитров. Далее трубка шприца подключается к выходному порту VMMC.

Скорость потока устанавливается таким образом, чтобы вызвать чистое напряжение в один дин на квадратный сантиметр внутри канала, а затем запускается в режиме наполнения таким образом, чтобы шприц вытягивал жидкость из резервуара через канал. Клетки ThP one, стимулированные SDF one, суспендируются в концентрации 2 миллиона клеток на миллилитр. В течение двух минут после активации потока в резервуар добавляют 50 микролитров клеточной суспензии.

Опять же, следите за тем, чтобы не вводить пузырьки воздуха при полном развитии потока. Видео захватывается со скоростью три кадра в секунду, а данные пересчитываются с помощью программного обеспечения Image J. Приверженец. ТГП в одной ячейке определяется как перемещение не более чем на одну половину диаметра ячейки за 10 секунд.

Здесь мы демонстрируем данные, показывающие адгезию THP к монослоям ha, стимулированным TNF альфа и обусловленным либо устойчивым напряжением сдвига высоких стенок в 15 динов на квадрат квадрата, либо колебательным напряжением сдвига равным нулю плюс-минус пять динов на квадратный сантиметр га, монослои, обусловленные колебательным напряжением сдвига, продемонстрировали в три раза большее рекрутирование TP на одну ячейку по сравнению с монослоями, которые испытали высокое напряжение сдвига. Сегодня мы демонстрируем использование настраиваемых методов in vitro, которые можно комбинировать, чтобы получить важную информацию о ранних воспалительных событиях, лежащих в основе атеросклероза. В частности, мы количественно оцениваем исходы, связанные с эндотелиальной дисфункцией и клетками, подвергшимися воздействию воспалительных стимулов в четко определенных гидродинамических условиях.

Использование VMM CS позволяет изучить специфические механизмы, лежащие в основе эндотелиальных и лейкоцитарных адгезионных взаимодействий. Эти устройства также имеют преимущество в том, что они являются гибкими и недорогими, а также облегчают использование материалов, поставки которых могут быть ограничены, таких как компоненты сыворотки, полученные от человека. Наши исследования с использованием этих устройств включали изучение цитокина, липидов и воспаления, вызванного яростью в эндотелиальных клетках.

Мы также разработали встроенные анализы, изучающие механизмы адгезии в нескольких типах лейкоцитов, а также в цельной крови. В конечном счете, мы предполагаем, что эта технология приведет к применению подходов ex vivo для оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний, опосредованных воспалением.