Озвучка обработка волокна Electrospun для тканевой инженерии

Целью данной процедуры является создание биоразлагаемых электроспиннинговых каркасов, которые могут быть стерилизованы, обладают достаточной толщиной и соответствующей механической прочностью для применения в клинической тканевой инженерии. Это достигается путем первоначального электроспиннинга биоразлагаемых полимеров в первичные архитектуры: случайные, выровненные и ориентированные или последовательно слоистые. На втором этапе к каркасам применяются модификации после спиннинга путем объединения нескольких слоев и их стерилизации.

Затем клетки заселяют в скаффолды, после чего оценивают их состояние в процессе и после культивирования. Заключительным этапом является воздействие на клетки режима физических нагрузок для имитации физиологического стресса, с которым клетки столкнутся в организме, с целью их подготовки к трансплантации. В конечном итоге мы можем оценить реакцию клеток на нагрузку, измерив количество вырабатываемого ими внеклеточного матрикса в ответ на динамическое напряжение.

Этот метод универсален и гибок, что позволяет создавать большое разнообразие скаффолдов со свойствами, модифицированными специально под конкретную задачу. Например, скаффолды могут быть разработаны для лечения сложных состояний, требующих восстановления тканей, таких как восполнение обширных потерь кожи у пациентов с тяжелыми ожогами или восстановление поврежденной слизистой оболочки полости рта после онкологических заболеваний или травм. Хотя в данном видео в качестве маркера динамического стресса демонстрируется устойчивая продукция клеток, вы также можете рассмотреть ряд белков внеклеточного матрикса или оценить многие другие аспекты биологии клеток, используя клетки в состоянии нагрузки или покоя.

Как правило, специалистам, которые только начинают осваивать данный метод, бывает трудно получить воспроизводимые скаффолды, поскольку на процесс электроспиннинга влияет множество переменных. Визуальная демонстрация обработки электроспиннинговых скаффолдов после завершения процесса имеет важное значение, однако она редко обсуждается.

Для успешного применения данной методики в клинической практике необходимо понимание сути процесса. Начните с обертывания вращающегося стержневого коллектора алюминиевой фольгой блестящей стороной наружу. Затем подготовьте четыре шприца объемом 5 мл, заполнив каждый из них 5 мл интересующего полимера.

В данном случае полимолочная кислота помещается в шприцевой насос. Установите скорость потока на 40 µL в минуту на один шприц, а рабочее расстояние от кончика иглы до мандреля — на 17 см. Затем подайте на иглы шприцев напряжение +17 000 В и произведите электроспиннинг с указанного расстояния на покрытый алюминиевой фольгой мандрель для получения ориентированных волокон.

Для получения случайным образом ориентированных волокон вращайте мандрель со скоростью 1000 RPM. Вращайте мандрель со скоростью 200 RPM. Электроспиннинговые каркасы можно хранить на алюминиевой фольге в герметичном контейнере при температуре four degrees Celsius в присутствии десиканта в течение как минимум четырех месяцев после электроспиннинга PHBV Lotus second polymer.

Здесь снова представлен тот же процесс. PLA продемонстрировал наслоение поверх PHBV с использованием параметров и стандартных условий электроспиннинга для данного полимера. Таким образом, этот аддитивный процесс позволяет формировать двойной слой каркаса, создавая бислойную структуру для получения многослойного каркаса с помощью нагревателя.

Положите четыре листа PLGA друг на друга, затем подвергните их термической обработке при 60 °C в течение трех часов для создания многослойного каркаса методом парового отжига. Налейте 10 мл дихлорметана (DCM) в контейнер подходящего размера. Затем снова положите четыре листа PLGA друг на друга и подвесьте их на высоте двух сантиметров над DCM.

Наконец, герметично закройте контейнер на один час при комнатной температуре для обеспечения асептического производства скаффолда методом электроспиннинга; растворите медицинские полимеры, стерилизованные путем инкубации, в DCM, а затем проведите электроспиннинг раствора полимера на стерильную фольгу, обернутую вокруг стерилизованного стержня. Затем в стерильном ламинарном шкафу инкубируйте скаффолд в безбиотической ростовой среде в течение соответствующего периода, чтобы подтвердить стерильность образцов после дезинфекции этанолом в соответствии с экспериментом.

Поместите скаффолды в раствор этанола и дистиллированной воды на 15 минут. Для стерилизации пероксиуксусной кислотой погрузите скаффолды в раствор пероксиуксусной кислоты и PBS на три часа.

Для гамма-стерилизации при комнатной температуре облучите скаффолды дозой 3 kGy с использованием источника цезия, после чего разрежьте скаффолды на прямоугольники размером 5 mm на 20 mm. Затем с помощью микрометра измерьте толщину скаффолдов. После этого поместите прямоугольники в прибор Bose ElectroForce 3100.

Рассчитайте модуль Юнга и упругость на основе зависимости нагрузки от смещения, представленной прибором в виде кривой {«напряжение — деформация»}. Начните с маркировки клеток флуоресцентным красителем перед их высевом. Затем инкубируйте конфлюэнтные дермальные фибробласты человека в растворе трипсина и EDTA в течение пяти минут при 37 °C.

Затем центрифугируйте отделенные клетки в течение 10 минут при 150 ×g при комнатной температуре и ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах DMEM. После подсчета доведите концентрацию клеток до необходимого значения для посева и высейте клетки на скаффолды. Теперь с помощью флуоресцентного микроскопа получите изображения поверхности меченых скаффолдов, чтобы исследовать проникновение клеток; для изучения более глубокого проникновения клеток в скаффолды можно использовать мультифотонный конфокальный микроскоп.

Это позволяет достичь глубины проникновения около 200 микрон в большинство скаффолдов, независимо от наличия в них клеток. После культивирования засеянных скаффолдов зафиксируйте образцы в одном миллилитре формальдегида в PBS в течение 20 минут при 37 °C. После фиксации промойте образцы трижды одним миллилитром PBS, затем инкубируйте каждый из образцов в 200 мкл первичных антител к эластину в течение 30 минут при 37 °C.

Промойте образцы еще три раза в 1 мл PBS, затем инкубируйте их в растворе вторичных антител в PBS, содержащем DPI, в течение 30 минут. Наконец, после последнего промывания образцов в PBS, проведите визуализацию на флуоресцентном микроскопе, используя возбуждение 365 нм и эмиссию 460 нм для DPI, а также возбуждение 480 нм и эмиссию 533 нм для вторичных антител. Сначала автоклавируйте аппарат регулирования потока и баллон, затем в чистом помещении распакуйте аппарат в ламинарном шкафу, установив его в позицию для электроспиннинга.

Далее подсоедините шприц объемом 50 мл, заполненный PBS, к боковому ответвлению трехходового крана и наполните баллон PBS до состояния упругости. Теперь нанесите методом электроспиннинга нужный полимер на баллон. При стандартных условиях спиннинга и рабочем расстоянии 10 см влажные волокна обладают достаточной адгезией, чтобы закрепиться на поверхности баллона без последующего отслоения.

После высыхания скаффолда поместите баллон в стерильный контейнер, а затем перенесите его в ламинарный шкаф, подходящий для культивирования клеток. Культивирование клеток на скаффолде, закрепленном на растянутом баллоне, для обеспечения биомеханического кондиционирования клеток является самой сложной частью данной процедуры. Необходимо многократно обмывать баллон клеточным суспензией, чтобы обеспечить прикрепление максимально возможного количества клеток к скаффолду.

По нашим данным, этот процесс занимает около 20 минут. В вытяжном шкафу снимите баллон из сосуда и поместите его на стерильную поверхность, например, в используемую здесь чашку Петри; каждую 20 секунд в течение 20 минут наносите суспензию клеток на покрытие баллона с помощью пипетки, чтобы попытаться равномерно распределить клетки по поверхности баллона. Затем поместите баллон обратно в культуральный сосуд и добавьте подогретую среду, соответствующую типу клеток.

Наконец, подсоедините аппарат для раздувания к шприцевому насосу и выполняйте раздувание и сдувание баллона по мере необходимости для обеспечения биаксиального растяжения. Для реализации более сложных режимов растяжения может быть использован компьютерный шприцевой насос. Для создания скаффолдов с хаотичной или упорядоченной архитектурой может применяться электроспиннинг.

Этот процесс воспроизводим, а волокна однородны. Например, перпендикулярные волокна можно создать путем электроспиннинга набора ориентированных волокон на алюминиевую фольгу, повернув фольгу на 90 градусов, а затем немедленно нанеся электроспиннингом второй набор ориентированных волокон поверх них. Электроспиннингу подвергать можно многие типы полимеров, характеристики которых могут значительно варьироваться, как показано здесь для P-L-A-P-H-B-V-P-C-L и PLGA; отметьте, что P-L-A-P-C-L и PLGA представляют собой однородные микроволокнистые скаффолды.

PHBV вытягивается в виде «жемчужного ожерелья», в котором нановолокна соединяют бусины размером от 5 до 20 микрон. В данном случае скаффолды изначально создавались с использованием PHBV, после чего шприцы заполнялись PLA, который наносился поверх скаффолдов из PHBV. На этих изображениях представлены типичные одиночные слои PHBV и PLA.

На этом изображении показано, как может выглядеть поперечный срез двухслойной структуры A-P-H-B-V-P-L-A с плотным нановолокнистым слоем PHBV и более открытым микроволокнистым слоем PLA; все три типа каркасов способствуют прикреплению и пролиферации клеток. Если требуются более толстые каркасы, для сплавления слоев между собой можно использовать воздействие паров и нагрев, как показано на следующих нескольких изображениях. Сплавленные слои каркаса не расслаиваются, и место соединения между ними может быть очень трудно обнаружить.

На этом изображении показан срез каркаса из PLA, полученного методом воздействий парами растворителя и термического сшивания, в котором были совмещены исходные волокнистые каркасы толщиной около 150 мкм. Затем пары DCM были использованы для создания значительно более толстых каркасов размером до 500 мкм. На данном изображении представлен тот же срез двухслойной структуры, полученной методом воздействия паров, при увеличении примерно в два раза большем, чем на предыдущем снимке; обратите внимание, как каркас состоит из слоев гораздо более толстых волокон, перемежающихся слоями более тонких волокон, созданных путем термического сшивания слоев тонких и толстых волокон для получения каркасов со сложными механическими свойствами.

На этом изображении снова показан один и тот же каркас с нагревательным элементом при четырехкратном увеличении. Предыдущее увеличение по слоям мембран может быть выполнено с различными типами клеток, каждая из которых культивируется на отдельной мембране без смешивания, что продемонстрировано на этих изображениях дермальных фибробластов человека, окрашенных двумя разными флуоресцентными красителями для отслеживания клеток. На первом изображении представлены фибробласты на электроспиннинговом PLA.

Клетки фиксировали и окрашивали; здесь окрашенные фибробласты были высеяны на электропряденые PHBV. В данном эксперименте фибробласты были предварительно окрашены витальным красителем CellTracker Green. Обратите внимание, что клетки расположены на стороне PLA бислоя.

На данном изображении представлен репрезентативный срез двухслойного материала с фибробластами, окрашенными в красный цвет на нижней поверхности PHBV, и фибробластами, окрашенными в зеленый цвет на верхней поверхности PLA. На этом снимке фибробласты были предварительно окрашены красителем Cell Tracker Red во время роста на поверхности A-P-H-B-V. Таким образом, использование витальных флуоресцентных красителей обеспечивает удобную методику анализа распределения клеток на скаффолде непосредственно в процессе их роста.

Метод стерилизации влияет на скаффолд и последующее культивирование клеток. На данном линейном графике показано влияние надоцетной кислоты, гамма-облучения и этанола на предел прочности при растяжении и модуль Юнга скаффолда из PLG.

Каждый из методов стерилизации изменяет предел прочности при растяжении и эластичность каркасов. Культивирование клеток на этих каркасах дополнительно снижает предел прочности при растяжении, но увеличивает эластичность. Данная столбчатая диаграмма иллюстрирует влияние метода стерилизации на диаметр волокон отдельного каркаса.

Гамма-облучение не оказывает существенного влияния на диаметр волокон, тогда как надпероксиуксусная кислота и этанол уменьшают его примерно на 50%. Таким образом, наилучшим способом получения стерильных скаффолдов является их изготовление в асептических условиях. Эта последняя серия изображений демонстрирует, что клетки остаются жизнеспособными при динамическом растяжении, а также вырабатывают повышенное количество эластина. Обратите внимание на появление темно-синего цвета, который создается растущими клетками и регистрируется с помощью метаболического индикатора MTT.

Здесь клетки, отмеченные синим цветом, которые культивировали на баллоне и подвергали биаксиальному растяжению, развили эластиновые волокна, что подтверждается зеленым окрашиванием. Это резко контрастирует с отсутствием эластина в случае, когда те же клетки содержали в статических условиях на идентичном баллонном каркасе. После данной процедуры можно применить другие методы, такие как статическое культивирование и воздействие потока жидкости на клетки в каркасах, чтобы исследовать реакцию клеток на различные условия культивирования.

Разработка метода культивирования клеток на скаффолде, закрепленном на расширяемом баллоне, оказалась очень полезной, так как она открыла исследователям в области тканевой инженерии возможность изучать влияние динамического кондиционирования клеток в тканеинженерных конструктах. Помните, что работа с источниками высокого напряжения, растворителями, лазерами и клетками человека может быть опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда проходить соответствующее обучение и соблюдать меры предосторожности.