Инженерные Приверженец бактерии путем создания единого синтетического Curli Operon

Общая цель данного эксперимента заключается в придании бактериям адгезивных свойств, облегчающих их отделение от жидких сред. Это достигается за счет разработки синтетических завитков, которые обходят сложную генетическую регуляцию и позволяют легко и массово производить липкие полимеры. В качестве второго шага адгезивные бактерии визуализируются и количественно оцениваются на полистироле, что позволяет быстро оценить эффективность синтетического устройства.

Далее адгезивная бактерия визуализируется на стекле с помощью конфокальной микроскопии. Для непосредственного наблюдения за биопленкой и получения информации о ее структуре получены результаты, которые показывают значительное увеличение адгезии штамма, содержащего синтетическое устройство, на основе как адгезии, процентного измерения, так и микроскопических наблюдений. Основное преимущество подхода синтетической биологии перед существующими методами, такими как обычное клонирование, заключается в том, что можно очень быстро получить конструкцию, содержащую только абсолютно чистые необходимые гены с соответствующими сигналами.

Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области биоремедиации, например, решить проблему удаления металлических бактерий из радиоактивных отходов. Как правило, у новичков в этом методе возникают трудности, так как требуются базовые знания о генетических регуляторных сигналах и работе с базами данных. Визуальная демонстрация будет сосредоточена на количественной оценке и визуализации биопленки, потому что эти два шага очень трудно освоить из-за хрупкости биокадров.

Первым шагом к созданию синтетического каррона является определение генетической организации курчавых генов и локализация их эндогенных, транскрипционных и трансляционных сигналов. Это достигается с помощью специализированных баз данных, таких как REON DB или eco gene. Следующим шагом является выбор пяти абсолютно необходимых генов для синтеза курчавых бактерий, CSGB и CSGA и кодирование мономеров волокон и C-S-G-E-C-S-G-F и CSGG, извлечение выбранных последовательностей из базы данных в более быстром управлении данными в формате и предварительный анализ in silico будет выполнен с помощью программного обеспечения для управления клонами, поскольку кластер C-S-G-G-F-E является антисмысловым в геноме кишечной палочки.

Эта последовательность должна быть преобразована в ее обратный аналог дополнения. Используйте инструменты менеджера клонирования, операции, обработайте молекулу, инвертируйте молекулу, вставьте последовательность C-S-G-E-F-G за C-S-G-B-A с помощью функции ligate. Затем добавьте соответствующий промотор PRCN перед последовательностью C-S-G-B-A-E-F-G iCal.

Локус RCN кодирует насос FLX RCNA, отвечающий за детоксикацию никеля и кобальта, и родственный ему металлорегулятор RCNR. В отсутствие кобальта или никеля репрессор RCNR связывается с коробкой RCNR на ДНК и предотвращает полную транскрипционную активацию нижестоящих генов. Если внутриклеточная концентрация кобальта или никеля повышается, связывание кобальта или никеля с белком RCNR препятствует фиксации репрессора к промотору, и транскрипционная активность P-R-C-N-A увеличивается за счет помещения пяти выбранных фигурных генов под контроль промотора.

Прогнозируется, что PRCN курчавый будет перепроизводиться в присутствии кобальта и никеля. Затем оптимизируйте транскрипционные сигналы путем добавления идеального сайта связывания рибосом, или RBS, перед первым A TG последовательности CS gba, DNA и второго идеального RBS перед последовательностью C-S-G-E-F-G. Чтобы соответствовать стандартам I GMs, устройство должно быть окружено стандартным префиксом bio brick, содержащим сайты ограничения для ECO R one и X-bar one, и суффиксом, содержащим сайты ограничения для SPE one и PST one для облегчения дальнейшей сборки.

Сама часть bio brick не может содержать никаких сайтов распознавания ECO R, PST one SPE и X-bar R one. Следовательно, эти сайты были устранены с помощью скрытых мутационных изменений в силико-рестрикционном анализе устройства, который выявил один PST, один сайт в последовательности CSGA, один PST один сайт в последовательности RCNR и один ECO R в гене CSGE. Эти сайты были модифицированы с помощью тихих мутаций.

После того, как проектирование синтетической операции будет завершено, проведите моделирование трансляции с помощью программного обеспечения для управления клонированием. Используйте программу выравнивания последовательностей blast для проверки идеальной гомологии между фигурными белками дикого типа и белками, кодируемыми синтетическим на, чтобы начать эту процедуру для каждой лунки 24-луночной полистирольной пластины с двумя миллилитрами М 63, минимальной средой с 0,2% глюкозой, инокулировать каждую лунку от 10 до шести клеток ночной бактериальной культуры. Выращивание бактерий при температуре 30 градусов Цельсия в течение 18-48 часов без встряхивания каждой колонны 24-луночного планшета представляет собой модальность.

При необходимости добавляется соответствующее количество кобальта и антибиотика. Три первых ряда используются для количественной оценки бактерий, адгезивных к А, путем усреднения трех повторений. Последний оставшийся ряд используется для визуализации биопленки путем окрашивания кристаллическим фиолетовым цветом через 18-48 часов, извлечения супината, содержащего планктонные клетки, из каждой лунки из первых трех рядов 24-луночного планшета и переноса супината в гемолизную трубку.

Тщательно промойте каждую лунку одним миллилитром среды М 63 и протяните промывку в гемолизной трубке с исходным супинатом. Этот бассейн называется плавательными ячейками под названием S. Дно лунок в микропланшете покрыто адгезионными ячейками. Чтобы восстановить биопленку, добавьте в каждую по одному миллилитру М 63.

Хорошо соскребите наконечником пипетки, а затем проведите пипеткой вверх и вниз и перенесите фракцию биопленки в новую трубку для гемолиза. Поворачивайте трубку в течение 15 секунд. Соберите биопленочную фракцию в пробирки для гемолиза.

Этот пул представляет собой поверхностные прикрепленные клетки, называемые В, которые переносят 200 микролитров супинатной и биопленочной фракции из гемолизных трубок на 96-луночный планшет. Оцените количество поверхностных и плавающих бактерий по оптической плотности в 600 нанометров. Процент адгезии для каждой модальности рассчитывается по формуле B умножить на 100, разделить на три раза S плюс B.To визуализировать биопленку только для последнего ряда из 24 лунок, отбрасывая планктонные клетки из этих лунок.

Добавьте по одному миллилитру М 63 в каждую лунку, чтобы промыть биопленку, которая образовалась на дне пластины. Высушите открытую пластину в течение одного часа при температуре 80 градусов Цельсия через час, добавьте 100 микролитров 20% кристаллической фиалки на двоих в каждую лунку, затем тщательно промойте водой. Для этого протокола требуется флуоресцентное шасси.

Подходящим хозяином для плазмиды, несущей синтетическую курчавость, является штамм E. coli SCC one, который конститутивно экспрессирует зеленый флуоресцентный белок без видимых отличий от родительского штамма MG 1 16 55. Трансформируйте штамм хозяина с помощью плазмиды Puck 57, несущей синтетические завитки, для получения штамма S 23. Трансформируйте штамм хозяина с помощью контрольной плазмидной шайбы 18 для получения контрольной деформации.

S 24 выращивают за ночь прекультуры штаммов S 23 и S 24 при температуре 30 градусов Цельсия. В среду М 63 с добавлением глюкозы и ампициллина на следующий день добавьте 20 миллилитров среды М 63 в чашку Петри, а затем введите 15 миллилитров М 63 в чашки Петри со 100 микролитрами предкультур. Добавьте соответствующую концентрацию кобальта и не забывайте об отрицательном контроле без кобальта.

Вставьте в каждую чашку Петри три прямоугольные стеклянные крышки. Высиживайте посуду в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия без встряхивания. Бактерии можно визуализировать непосредственно под флуоресцентным микроскопом в последующие дни.

Важно избегать пересыхания образца, поэтому следующие действия необходимо выполнять аккуратно, но быстро. Снимите каждую крышку с чашек Петри и осторожно слейте воду. Осторожно очистите нижнюю часть лица небольшим ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле, чтобы стереть все остатки бактерий для конфокального наблюдения.

Положите защитный листок на предметное стекло верхней лицевой стороной, закрытой биопленкой, лежащей лицевой стороной вверх. Затем биопленка покрывается более крупным покровным стеклом, который фиксируется на стекле. Горка с лаком.

Переверните установку так, чтобы биопленка теперь была на нижней грани. Поместите установку под конфокальный лазерный микроскоп в этом эксперименте. Конфокальный лазерный микроскоп Zeiss LSM five 10 meta используется в микроплатформе КТ.

Выберите цель 40-кратного погружения в масло. Используйте следующие настройки, возбуждайте GFP на 4 88 нанометрах и собирайте бактериальную флуоресценцию в диапазоне от 500 до 600 нанометров. Используйте объектив для 40-кратного погружения в масло для получения изображений.

В лазерном сканировании конфокальный режим. Отсканируйте общую трехмерную структуру биопленок от твердой поверхности до границы раздела с питательной средой. С помощью шага в один микрон.

Выполнение трехмерных проекций с помощью программного обеспечения MAUS, определение толщины биопленки путем анализа среднего значения C по статистическим продольным сечениям. Количественное определение биопленки, биообъемы могут быть экстрагированы из конфокальных Z-стеков. Адгезионные способности кишечной палочки, сконструированной для перепроизводства курчавости в ответ на металл, могут быть оценены простыми методами.

Например, кристаллическое фиолетовое окрашивание на 24 хорошо отполированных пластинах Irene позволяет быстро визуализировать образование биопленки на дне каждой скважины, о чем свидетельствует разница в интенсивности фиолетового цвета. Похоже, что штамм дикого типа менее адгезивный, чем сконструированный штамм. Количественный метод заключается в измерении процентной адгезии полистирола дикого типа и сконструированных штаммов с различными концентрациями кобальта.

Результаты, представленные на этом графике, показывают, что процент адгезии сконструированного штамма в 1,5 раза выше, чем у штамма дикого типа в отсутствие кобальта. Кроме того, значительное усиление адгезии в присутствии возрастающих концентраций кобальта наблюдалось в средах с концентрациями кобальта 25 микромоляров или 50 микромолярных процентов адгезии сконструированных клеток достигали 30% и 40% соответственно. Адгезивные способности также можно сравнить с помощью микроскопии с бактериями с мечкой GFP, выращенными на предметных стеклах, наблюдения за зелеными бактериями на черном фоне с помощью эпифлуоресцентной микроскопии показывают, что сконструированный штамм образует биопленку, в то время как дикий штамм триппе образует только микроколонии, обозначенные стрелками.

Анализ с помощью конфокальной микроскопии позволяет получить общее представление о трехмерной структуре биопленки. Реконструкция вида сверху показана на панели А, а реконструкция вида сбоку показана на панели В. Результаты подтверждают, что сконструированный штамм является более адгезивным и образует более плотную и толстую биопленку, чем дикий тип. При попытке выполнить эту процедуру важно перепроверить конструкцию операции, например, чтобы изучить потенциал биопосредничества модифицированных кишечных палочек или осьминоговых муравьев в контексте радиоактивных сточных вод.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как спроектировать синтетическое отверстие с помощью программного обеспечения для управления клонированием и как быстро количественно оценить высказывание бактериальных штаммов. Не забывайте, что работа с синтетическими генами и генетически модифицированными организмами может быть крайне опасной. Они должны находиться под действием действующих законов, и при выполнении этой процедуры всегда должны приниматься меры предосторожности, такие как автоклавирование трансформированных бактерий.