Оптимизирована процедура для флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) Выделение вегетативной нервной прародителей из висцеральных органов плода мышей

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить популяцию очищенных нейрональных предшественников из ганглиев периферической нервной системы. Это достигается путем препарирования представляющего интерес органа или конкретных ганглиев у эмбриональных мышей. Затем ткани частично диссоциируют, чтобы высвободить отдельные клетки в окружающую среду.

Затем клеточная суспензия фильтруется, чтобы удалить любые остаточные тканевые комки или крупные агрегаты. Наконец, клеточную суспензию сортируют по потоку для выделения интересующей популяции на основе экспрессии флуоресцентного репортера в этой популяции клеток. В конечном счете, паттерны экспрессии генов могут быть сравнены между предшественниками, выделенными на разных стадиях развития, или между очищенными популяциями различных типов нейронных клеток.

Основное преимущество этой методики перед выделением клеточных популяций на основе мечения антителами заключается в том, что часто иммунореагенты недоступны. Эти маркирующие клетки, экспрессирующие определенный ген, генетически модифицированные линии мышей, которые производят флуоресцентный белок в дискретных подмножествах нейронов, позволяют изолировать эти клеточные популяции. Хотя мы демонстрируем этот метод для выделения нейр-предшественников из кишечника и нейрогенного тракта рта, он также может быть применен к другим модельным системам, экспрессирующим флуоресцентные репортеры.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они склонны к чрезмерному перевариванию исходных тканей, что приводит к потере жизнеспособности клеток. Перед началом вскрытия рассмотрите эмбрионы при яркопольном освещении, чтобы убедиться, что соответствующие структуры находятся в фокусе. Затем определите трансген-положительные эмбрионы путем скрининга экспрессии флуоресцентного репортера с помощью флуоресцентного стереомикроскопа.

После эвтаназии эмбрионы начинают с добавления минимального количества PBS в чашку для вскрытия, чтобы эмбрион не плавал во время препарирования тканей. Вскройте кожу эмбриона по бокам тела и поперек брюшной полости на уровне печени. Переверните эмбрион на спину и с помощью тонких щипцов прикрепите его к месту.

На уровне передних конечностей введите еще одну пару щипцов на уровне диафрагмы, и далее резво. Потяните внутренние органы вниз к хвосту и в сторону от стенки спинного тела, чтобы удалить внутренние органы от печени вниз к генитальному бугу. Если какие-либо органы из грудной полости, такие как сердце или легкие, прикрепляются к внутренним органам, удалите их, прежде чем двигаться дальше.

После того, как брюшные внутренности отделены от туши, вставьте пару щипцов ниже печени, рядом с желудком, и осторожно отожмите печень от кишечника. Затем аккуратно рассекают заднюю кишку в сторону от дорсальной уретры и удаляют кишечник из урогенитального тракта. Наконец, переверните кишечник так, чтобы селезенка была видна под желудком.

Удалите селезенку и поджелудочную железу. Раздвиньте петли кишки, держась за брыжейку. Затем отделите брыжеечную и сопутствующую сосудистую сеть из кишечника, аккуратно потянув за брыжеечник.

Избегайте удержания кишечника непосредственно щипцами. Если кишечник разрывается, просто соберите отдельные кусочки на этапе диссоциации. Объедините каждый тип ткани в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую ледяной HBSS в соответствии с типом ткани и типом фенотипа эмбриона.

После гранулирования подрасчлененные ткани аспирируют как можно больше HBSS. Затем повторно суспендируйте тканевую гранулу в объеме от одного до нескольких миллилитров ACU max. Замена наконечников пипеток между каждым образцом.

Чтобы избежать перекрестного загрязнения типов тканей, поместите трубки в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия на 20-45 минут. В зависимости от стадии выделения ткани, диссоциация и фильтрация ткани является самой сложной частью процедуры для предотвращения явной диссоциации ткани. И как следствие – низкая жизнеспособность клеток.

Ограничьте время диссоциации и не пытайтесь полностью диссоциировать все кусочки ткани на полпути. А по истечении времени диссоциации вручную разбейте ткань, энергично ударив трубку о стенку водяной бани и бросив трубку вниз резким движением запястья. Теперь переместите диссоциированные образцы на лед и немедленно добавьте по одному миллилитру свежеприготовленной закалки в каждую пробирку с помощью нового наконечника для пипетки для каждого образца, передвигайте образец вверх и вниз до тех пор, пока ткань не будет почти полностью диссоциирована.

Теперь с помощью пары стерилизованных этанолом щипцов поместите трехсантиметровый квадрат нейлоновой сетчатой мембраны 38 микрон на устье новой конической трубки объемом 15 миллилитров. Затем с помощью узких наконечников можно отфильтровать раствор отдельных ресуспензионных клеток через сетку путем пипетирования в центр мембраны. После того, как клеточная суспензия будет отфильтрована, промойте пробирку с образцом одним миллилитром гасителя от одного до пяти и отфильтруйте все оставшиеся клетки.

Затем удалите мембрану, стараясь не допустить попадания в пробирку неотфильтрованных образцов тканей. После гранулирования клеточные суспензии отсасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в одном миллилитре гаски от одного до пяти. Затем отфильтруйте каждую клеточную суспензию через нейлоновую сетку в пятимиллилитровые полистирольные трубки, как показано выше.

Начните с резервирования небольшой аликвоты флуоресцентного образца для контроля компенсации только EGFP. Затем разделите образец ткани дикого типа на две части, обозначив только один дикий тип, а другой семь A a d.Only. Теперь заполните все пробирки с образцами закалкой от одного до пяти, и после гранулирования образцы аспирируют все, кроме последних 200 микролитров надосадочной жидкости в каждой пробирке.

Наконец, добавьте семь a a d к образцам, которые нужно отсортировать, и семь a a d только контроль. Затем добавьте 0,75 миллилитров триазола LS в 1,5 миллилитровую микроцентрифугу. Пробирки для сбора образцов начинаются с использования контрольных образцов для установки параметров компенсации и стробов, чтобы избежать семи A a D положительных мертвых клеток и собрать клетки с высокой интенсивностью флуоресценции GFP.

После установки параметров компенсации начните сортировку при минимально возможном давлении с широким отверстием и низким расходом. Соберите максимум 25 000 клеток в каждую микроцентрифужную пробирку, чтобы триол LS не был чрезмерно разбавлен. Сразу после сортировки вихря, каждая трубка клеток захватывается в триол лс.

На этом первом рисунке показана целая гора европейских генитальных путей через 15,5 дней после полового акта, наблюдаемая вентрально при яркопольном освещении. Тот же образец рассматривают при флуоресцентном освещении, чтобы продемонстрировать распределение EGFP-положительных клеток в надпочечниках и медиально расположенных чревных ганглиях, определяемых их экспрессией трансгена TH EGFP. На этом боковом снимке мочевого пузыря через 15,5 дней после cotus TH EGFP sub демонстрируется флуоресценция экспрессии трансгенов в тазовых ганглиях, стенке мочевого пузыря и мочеиспускательном канале.

На этом дорсальном снимке тех же EGFP-положительных клеток проявляется диссоциация тканей передней дорсальной уретры для производства клеточных суспензий для сортировки потоком, это тонкий баланс между адекватным ферментативным перевариванием и предотвращением чрезмерного переваривания, которое может привести к низкой вариабельности клеток. На этих микрофотографиях видны нижние части урогенитального тракта и ткани кишечника на полпути к времени диссоциации. Как видно на этих фотографиях надлежащим образом переваренной ткани до и после ручного лечения, три кусочка подрасчлененных органов все еще ясно видны в тканях, которые обрабатываются ферментами слишком долго или при слишком высокой концентрации фермента.

Тем не менее, в полученной суспензии отсутствуют какие-либо остаточные крупные куски ткани, соответствующая диссоциация, и ручная фильтрация приводит к профилям проточной цитометрии, которые обычно демонстрируют более 90% жизнеспособных клеток, и те клетки, которые экспрессируют репортер в этой жизнеспособной популяции, сохраняют высокую экспрессию EGFP высокой интенсивности. Чернокожее население состоит из одиночных клеток, которые мертвы и помечены поглощением семи флуоресцентных клеток. Серая популяция состоит из синглетных клеток, основанных на прямом и боковом рассеянии, которые исключают семь a a d и, таким образом, являются жизнеспособными.

Зеленая популяция находится в зоне с GFP-положительным результатом и состоит из одиночных жизнеспособных клеток, которые исключают семь A-d, и которые демонстрируют флуоресценцию EGFP. С помощью этой процедуры можно провести выделение предшественников нейронов из других периферических тканей, таких как симпатическая цепь, дорсальный корешок, ганглии или легкое, чтобы ответить на вопросы о различиях в профилях экспрессии генов между популяциями или о развитии различных линий.