Гальванотаксис пробирного анализа нейронных клеток-предшественников Кинетика миграции извне постоянного тока электрическое поле

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации миграции взрослых клеток-предшественников нервов в присутствии электрического поля постоянного тока. Это достигается путем выделения и культивирования субэпендимальных нейральных клеток-предшественников у взрослой мыши. Следующим этапом является подготовка камер Galvan Axxis и перенос нейронных клеток-предшественников в камеры.

Последним шагом является подача электрического поля постоянного тока через камеру Galvan Axxis и выполнение покадровой визуализации для наблюдения за миграцией нейропредшественников. В конечном счете, покадровая микроскопия фиксирует тактические свойства Гальвана нейропредшественников в их дифференцированном и недифференцированном состояниях. Хотя этот метод может дать представление о гальваническом оазисе клеток-предшественников нейронов, он также может быть применен к другим системам, таким как модель инсульта мыши для привлечения нейропредшественников к местам поражения для улучшения восстановления нейронов.

Демонстрировать процедуру будет Роб Пилли Пост, аспирант из моей лаборатории. Приступая к этой процедуре, NPC должны находиться в культуре в течение семи дней, чтобы свободно плавающие первичные нейросферы были готовы к сбору урожая. При необходимости начните подготовку трех камер Galvan Axxis, поместив три квадратных стакана.

Во-первых, крышка проскальзывает в бутылку с шестью обычными соляной кислотой на ночь. Рано утром на следующий день положите гель matra, чтобы он медленно оттаял на льду. Через четыре часа он будет готов к использованию для строительства камеры.

Во-первых, используйте стеклорез с алмазным наконечником, чтобы вырезать шесть прямоугольных полос стекла из нового квадрата. Во-первых, обложка. Переложите промытые кислотой квадратные и прямоугольные шликеры в колпак с ламинарным потоком.

Промойте стеклянные полоски 70% этанолом, а затем обработайте его водой для тканевых культур. Дайте им высохнуть на воздухе или высушите их на безворсовой бумаге. Далее нанесите вакуумную смазку по периметру одной поверхности каждой квадратной стеклянной горки и приклейте их к основанию из 60-миллиметрового пластика.

Чашки Петри. Нанесите вакуумную смазку на одну сторону прямоугольных стеклянных полосок и запечатайте их на противоположных краях квадрата. Стеклянные горки для создания квадратов с центральным корытом в центре каждой посуды.

УФ-стерилизация этих модифицированных стеклянных квадратов или камер в течение не менее 15 минут в вытяжке. Далее пипеткой внесите от 250 до 300 микролитров полиоллизина в центральное желобо камер. Затем инкубируйте камеры при комнатной температуре в течение двух часов, примерно за 15 минут до окончания инкубации.

Приготовьте раствор геля матри через два часа, отсадите полиоллизин и промойте центральные кормушки одним миллилитром автоклавной воды. Затем нанесите пипеткой от 250 до 300 микролитров раствора геля Матри на центральные кормушки и инкубируйте камеры при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. После инкубации отсасывайте раствор матригела.

Затем аккуратно промойте центральные кормушки одним-двумя миллилитрами SFM. Теперь нанесите пипеткой 100 микролитров E-F-H-S-F-M или F-B-S-S-F-M на центральные борозды для подготовки к культивированию клеток. Затем пипеткой четыре-пять миллилитров нейросферы, содержащей культуру, в новую 60-миллиметровую чашку Петри.

Затем поместите чашку Петри на столик счетного микроскопа под пятикратным объективом обзора. С помощью пипетки P 10 аккуратно перенесите пять-восемь целых нейросфер в центральное желоб каждой камеры. До четырех.

Нейросферы могут быть перенесены сразу, но не диссоциируйте их с нейросферами в центральных впадинах. Аккуратно разложите их вокруг, не нарушая материальный субстрат. Затем добавьте еще 150 микролитров E-F-H-S-F-M или F-B-S-S-F-M на центральные кормушки.

Теперь культура, клетки в увлажненном инкубаторе. После 17–20 часов в культуре недифференцированные NPC будут доступны через 69–72 часа. В культуре будут доступны дифференцированные NPC.

Под бухгалтерским микроскопом выберите камеру с лучшими клетками для анализа миграции живых клеток. Клетки должны быть круглыми, почти полностью диссоциированными от своих нейросфер и еще не имеющими, или только начавшими формировать процессы в вытяжке. Подготовьте крышку камеры.

Промойте квадратную стеклянную крышку с 70% этанолом, затем автоклавной водой и нанесите полоску вакуумной смазки на два параллельных края. Теперь накройте камеру. Сначала отсасывайте питательную среду из центрального корыта, а затем быстро запечатывайте крышку, надвигайте на прямоугольные стенки как крышу.

Далее, используя капиллярное действие, загрузите в центральную кормушку 100 микролитров свежей среды. Теперь используйте вакуумную смазку для создания бордюров для бассейнов питательных сред. На каждом конце центрального желоба в системе визуализации живых клеток подготовлены гелевые трубки, электроды из серебра, хлорида серебра и две 60-миллиметровые чашки Петри для использования.

В качестве резервуаров для питательных сред позвольте камерам отдохнуть в среде с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20-30 минут. За это время подготовьте крышки двух пустых чашек Петри и крышку чашек Петри из камер Гальвана Аксиса, просверлив в них отверстия с помощью пипетки Dremel или инструментальной пипетки, 1,5-2 миллилитра среды по обе стороны от центрального желоба и добавьте семь-восемь миллилитров SFM в каждую пустую чашку Петри. Поместите по одной чашке Петри с каждой стороны центрального желоба камеры и поместите по одному электроду в каждую чашку.

Устраните зазор между камерой и чашкой Петри, чтобы обеспечить электрическую непрерывность. С помощью гелевых мостиков Агрос подключите электроды к внешнему источнику питания с помощью М-метра последовательно для измерения электрического тока и включите источник питания. С помощью измерителя объема измерьте силу электрического поля непосредственно на центральном желобе.

При необходимости отрегулируйте выходную мощность блока питания. Теперь запустите модуль интервальной съемки в системе обработки изображений. В программном обеспечении машинного зрения Axio выберите многомерное сканирование и нажмите «Смотреть».

Для каналов выберите шестой канал, нажмите T для замедленной съемки. Установите настройки интервала интервальной съемки равной одной минуте, установите продолжительность равной восьми часам в полях до и после временных точек, выберите временные точки до и после. Теперь нажмите кнопку «Пуск» и дайте эксперименту продолжаться в течение желаемого периода времени после завершения анализа, а затем перенесите анализ ИГХ.

Кинематический анализ показал, что в присутствии 250 милливольт на миллиметр DCEF недифференцированные NPC демонстрируют высоконаправленный и быстрый гальванический аксис к катоду при этой напряженности поля, более 98% недифференцированных NPC мигрировали в течение всех шести-восьми часов, в течение которых они были визуализированы. При отсутствии A-D-C-E-F. Наблюдалось хаотичное движение клеток.

Поскольку мертвые клетки не мигрируют, это говорит о том, что они сохраняют жизнеспособность в этот период. При отсутствии или присутствии A-D-C-E-F дифференцированные фенотипы претерпевали незначительную миграцию, как при наличии, так и в отсутствии подмножеств дифференцированных клеток A-D-C-E-F. Расширенные отростки, которые имели тенденцию выравниваться перпендикулярно направлению DCEF, но заметной транслокации клеточного тела не наблюдалось.

Иммуноокрашивание подтвердило, что NPC сохраняли положительную экспрессию гнезда маркеров нейральных предшественников после шести часов воздействия DC EF. В анализах с участием NPC, индуцированных к дифференцировке в зрелые фенотипы, большинство клеток экспрессируют зрелый маркер астроцитов глиальный фибриллярный кислый белок или GFAP после шести часов воздействия DCEF. Следуя этой процедуре, можно получить представление о клеточных механизмах, которые участвуют в преобразовании электрического поля постоянного тока в подвижность клеток, используя генетические модели нокаута.

Или сэр, например.