Электричество-Free, последовательное нуклеиновых кислот и белков изоляции

Общая цель данной процедуры заключается в выделении нуклеиновых кислот, готовых для ПЦР, и иммунореактивного белка из образца без необходимости использования электроэнергии или лабораторной инфраструктуры. Выделение нуклеиновых кислот и белков начинается со смешивания образца с гуанидином и тиоцианатом для лизиса образца и пропускания смеси через сорбент в экстракционной пипетке. После пятого и заключительного прохождения через сорбент перенесите смесь в буфер для экстракции белка и отставьте в сторону для последующего выделения иммунореактивного белка.

Затем сорбент и связанные с ним нуклеиновые кислоты промывают, пропуская через сорбент 95% ethanol. После этого сорбент и связанные нуклеиновые кислоты несколько раз высушивают, продувая сорбент окружающим воздухом в течение пяти минут. Заключительным этапом выделения нуклеиновых кислот, готовых для ПЦР, является элюирование нуклеиновых кислот из сорбента с использованием 250 µL tris или другого аналогичного водного раствора для выделения иммунореактивного белка.

После смешивания образца и буфера для экстракции белка возьмите вторую экстракционную пипетку и пропустите смесь через сорбент 15 раз. Следующим шагом является промывка сорбента с связанным белком путем многократного пропускания 95% ethanol через сорбент. Затем сорбент и связанный белок высушивают, продувая сорбент окружающим воздухом в течение пяти минут.

Заключительным этапом протокола является элюция белка из сорбента. В конечном итоге, экстракционная пипетка, используемая в данной процедуре, позволяет осуществлять выделение нуклеиновых кислот, готовых к ПЦР, и иммунореактивного белка без использования электрического тока. Здравствуйте, меня зовут Дейв Павловски.

Я старший научный сотрудник компании Kubrick Incorporated в Буффало, штат Нью-Йорк. Сегодня мы изучим методику, которая позволяет последовательно изолировать как белки, так и нуклеиновые кислоты без использования центрифуги, вортекса или любого другого дополнительного лабораторного оборудования. Перед лизисом образцов убедитесь, что они находятся в жидком виде. Если образец твердый (например, пищевой продукт или кал), его следует суспендировать в жидкой среде, такой как вода или фосфатно-солевой буферный раствор.

Смешайте 500 µL образца с 500 µL 6 M гуанидинтиоцианата в пробирке объемом 1.5 мл. Затем нажмите на грушу экстракционной пипетки, чтобы вытеснить из нее воздух. Медленно отпуская грушу, втяните весь образец объемом 1 мл в экстракционную пипетку через абсорбирующий материал.

Переверните инструмент для экстракции так, чтобы сорбент и образец стекли в колбу. Разотрите гранулы сорбента вместе с образцом в колбе, стараясь не вытолкнуть образец из экстракционной пипетки.

Переверните экстракционную пипетку и вытолкните образец в исходную пробирку объемом 1.5 milliliter. Втяните весь образец объемом one milliliter в экстракционную пипетку, пропуская его через сорбент с умеренной скоростью. Осторожно, чтобы сорбент оставался в горлышке экстракционной пипетки, вытолкните весь образец в пробирку объемом 1.5 milliliter, нажав на грушу.

Повторите этот процесс, пропуская образец через сорбент еще четыре раза, чтобы в сумме получилось пять проходов. После пятого прохода через сорбент вытолкните весь образец объемом 1 мл в 4 мл буфера для экстракции белков в конической пробирке объемом 15 мл. Перемешайте содержимое пробирки путем инверсии, затем закройте ее и отставьте до дальнейшего использования.

Промойте выделенные нуклеиновые кислоты, трижды пропустив один миллилитр 95% ethanol через сорбент, возвращая ethanol в исходную пробирку. После этого повторите промывку еще три раза, используя второй миллилитр 95% ethanol. Следующим этапом процедуры является сушка сорбента; извлечение нуклеиновых кислот проходит наиболее эффективно, когда сорбент сухой.

Я понимаю, что этот этап утомителен. Однако, если вы выполните его в рекомендованный промежуток времени, результаты будут лучше. Нажимайте и отпускайте грушу в течение пяти минут.

Пропустите окружающий воздух через экстракционную пипетку, чтобы высушить нуклеиновые кислоты и сорбент, затем удалите остатки этанола с кончика экстракционной пипетки салфеткой. С помощью салфетки Kim wipe элюируйте нуклеиновые кислоты, пять раз пропустив через сорбент 250 µL 10 mM Трис-буфера. Трис-буфер можно заменить любым другим подходящим водным раствором, например, PBS.

Полученный раствор содержит экстрагированные нуклеиновые кислоты. Чтобы сначала провести экстракцию белков, смешайте образец с буфером для экстракции белков, который был отставлен заранее, путем переворачивания пробирки. Перенесите примерно два-три миллилитра этого пятимиллилитрового образца на сорбент новой экстракционной пипетки. Вытолкните весь образец в ту же коническую пробирку объемом 15 миллилитров, стараясь удерживать сорбент в горлышке экстракционной пипетки.

Повторите этот процесс, пропустив образец через сорбент 15 раз. Промойте сорбент и связанный белок, пропустив через слой сорбента один миллилитр 95%Ethanol три раза, сливая этанол в исходную пробирку; затем промойте еще три раза, используя второй миллилитр промывочного раствора 95%ethanol.

Следующим этапом процедуры является повторное высушивание сорбента. Как и в случае с нуклеиновыми кислотами, высвобождение белков происходит наиболее эффективно, когда сорбент высушен в течение более длительного периода времени.

Нажимайте и отпускайте грушу в течение пяти минут, пропуская окружающий воздух через экстракционную пипетку. Чтобы высушить слой белкового сорбента, удалите остатки этанола с кончика экстракционной пипетки. С помощью салфетки Kim wipe элюируйте белок, пять раз пропустив 250 µL PBS через сорбент.

Буфер PBS можно заменить любым другим подходящим водным раствором, например, 10 мМ Tris с pH 6,8. Полученный раствор содержит белки образца. Гены шига-токсина, ассоциированные со штаммом entero hemorrhagic e coli oh 1 5 7 H seven E DL 9 33, были амплифицированы из экстракта нуклеиновых кислот и белков, полученного с помощью экстракционной пипетки.

Гены шига-токсина, шига-токсин 1 и шига-токсин 2, находятся на умеренных lambda-подобных бактериофагах и дефектных бактериофагах под контролем промотора PR. Активация SOS-ответа в e coli приводит к индукции профага и/или продукции токсина. В данном случае наблюдается значительное увеличение амплификации гена шига-токсина 2 при индукции SOS-ответа митомицином C по сравнению с необработанным контролем.

Это указывает на индукцию профага и репликацию генома фага. Белок, выделенный в ходе экспериментов по изоляции нуклеиновых кислот и белков, описанных в видео, обладает иммунореактивностью. Изолированная белковая фракция была нанесена на тест-полоски для экспресс-анализа E. coli O157 методом латерального потока.

Контроли демонстрируют положительную идентификацию во всех образцах, содержащих e coli oh 1 5 7, с индукцией или без индукции shiga toin, что визуализируется в виде двух красных полос. Данные также показывают положительные результаты для тех образцов, содержащих e coli oh 1 5 7, в которых выделение нуклеиновых кислот и белков проводилось с использованием экстракционной пипетки. Эти данные свидетельствуют о том, что изолированный белок из каждого образца иммуноактивен и, следовательно, вызывает положительный ответ.

Выделенный белок пригоден для электрофореза, что продемонстрировано здесь на 8% акриламидном геле, окрашенном кумаси, с нанесением BSA, выделенного из шестимолярного изотиоцианата гудина. При использовании данной экстракции, пипетки и соответствующего протокола электрофоретическая подвижность выделенного белка идентична подвижности контрольных образцов. После освоения метода выполнение данной процедуры занимает менее 20 минут.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как выделять белки и нуклеиновые кислоты с помощью этого простого устройства. Благодарим вас за внимание к нашему видео.