Содействие Drug Discovery: Автоматизированные высокого содержания воспаление Анализ в данио рерио

Общая цель этой процедуры заключается в проведении фенотипического скрининга для определения иммуномодулирующей активности соединений с использованием анализа воспаления рыб данио in vivo. Это достигается путем предварительного распределения личинки рыбы данио среди 384. В лунную тарелку следующие соединения, подлежащие скринингу, добавляются к личинкам, чтобы обеспечить проникновение в ткани.

Затем добавляется раствор медного купороса для нанесения специфического повреждения тканей. Наконец, соединения и медный купорос заменяются свежей средой. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают степень тканеспецифического притока лейкоцитов с течением времени путем анализа данных микроскопии in vivo в реальном времени.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет одновременно вызывать воспаление у сотен людей и тем самым обеспечивает экспериментальную и аналитическую автоматизацию. Демонстрировать процедуру будет Кристина Уитман, аспирантка из моей лаборатории по анализу подбородка. Устанавливают групповые спаривания между гомозиготными двойными трансгенными и дикими рыбами типа АВ, собирают зародыши путем естественного нереста и выращивают от 50 до 70 на тарелку в трех средах Е при температуре 29 градусов Цельсия в течение трех дней после оплодотворения.

Проверьте всех личинок под флуоресцентным стереоскопом на предмет экспрессии флуоресцентных репортеров, спонтанного воспаления и соответствующего возрастного развития. После приготовления просеивающей среды и добавления 20 мкл в лунки 384, лунки планшетом переносят одну обезболенную личинку в 74 мкл среды в каждую лунку. Использование наконечника для дозатора, обрезанного до диаметра отверстия два миллиметра, с гибким наконечником для микропипетки.

Ориентация личинки в боковом положении в пределах лунки Выполнение всех последующих этапов работы с жидкостями с помощью роботизированной рабочей станции для работы с жидкостями, чтобы обеспечить одновременную обработку всех личинок для медикаментозного лечения. Проводите пипеткой вверх и вниз пять раз, чтобы смешать соединения в планшете с лекарственным препаратом. Добавьте 16 микролитров из 7,5-кратного запаса лекарств в тарелку для скрининга и перемешайте пять раз со скоростью 10 микролитров в секунду.

Накройте просеивающую пластину алюминиевой фольгой и выдержите ее в течение часа при температуре 29 градусов Цельсия. Вызвать химическое ранение. Добавьте в каждый по 10 микролитров 120 микромолярного рабочего раствора медного купороса.

Хорошо примите отрицательный контроль, смешайте четыре раза и снова инкубируйте в течение одного часа при температуре 29 градусов Цельсия. Промойте эмбрионы, вынув и заменив 80 микролитров среды из каждой лунки дважды, начиная с 90 минут. После первоначальной обработки медью получите изображения на перевернутом автоматическом микроскопе с помощью объектива Forex.

Установите начальный уровень Z так, чтобы была видна нейромасса от правой и левой задней боковой линии, и визуализируйте каждую лунку один раз в час. Использование стороны Brightfield трех и GFP каналов в четырех фокальных плоскостях. Пользовательское программное обеспечение для просмотра лабораторных работ создает изображения с расширенным фокусом из четырех фокальных плоскостей для каждого из каналов.

Затем изображения объединяются для создания окончательного изображения наложения RGB. Инструмент распознавания образов идентифицирует невриномы в изображениях наложения RGB и создает эмпирически определенную область интереса вокруг неврином: оцениваются красные флуоресцентные лейкоциты, окружающие поврежденные невриномы, что приводит к первичному считыванию процентной площади, занятой лейкоцитами или бледными. В среднем 95% личинок обнаруживаются должным образом и впоследствии могут быть подвергнуты дальнейшей обработке данных.

Успех отдельных экспериментов оценивается с помощью карт воспаления или глазных карт. Бледные данные имеют цветовую кодировку ярко-зеленым цветом, представляющим высокий начальный индекс воспаления, а черный указывает на отсутствие воспаления. Этот краткий обзор позволяет быстро выявить неудачные эксперименты, которые затем могут быть исключены из дальнейшего анализа данных.

iMaps в момент времени 0,0 и 0,5 ясно показывает, следует ли включать эксперимент в дальнейшую обработку данных. Медные контрольные лунки отображаются в различных оттенках зеленого, в то время как контрольные лунки ДМСО отображаются в темно-зеленом или черном цвете в момент времени 0,5. Воспаление почти полностью исчезло в медных контрольных приборах, которые теперь обозначены темными оттенками зеленого или черного для обработки контроля.

32 контрольные реплики усредняются и вычисляется стандартное отклонение. Только. Учитываются точки данных в пределах двух стандартных отклонений. Среднее значение отрицательного контроля ДМСО устанавливается равным нулю, а максимальное среднее значение PAOL для контроля меди устанавливается равным единице. PAOL каждого соединения линейно, интерполируется или экстраполируется на соответствующие контрольные элементы на экспериментальной пластине.

Нормализованные исходные данные повторных экспериментов усредняются с получением окончательного считывания, индекса воспаления из-за разрешения воспаления. Со временем выполняется монотонная экспоненциальная нелинейная регрессионная аппроксимация по направлению к исходному воспалению. Используя эту формулу, где ноль является мерой начального ответа в момент времени, равным нулю, а единица связана с наклоном величины во времени для создания пространства признаков, применяется нелинейная регрессия, и кластерный анализ делит пространство признаков на характерные области, что позволяет автоматически идентифицировать интересных кандидатов из различных иммуномодулирующих категорий.

Все параметры отображаются на 2D-графике на основе параметров ACE нуля и ace равного единице. Процедуры обработки данных создают веб-страницы, которые обеспечивают быстрый обзор результатов, а также подробный просмотр по запросу пользователя. Мягкие ссылки на другие соответствующие гетерогенные биологические и химические базы данных также интегрированы, чтобы обеспечить ценный ресурс для сравнительных и новых исследований с помощью этих процедур.

Для долгосрочного хранения этих данных в пилотном скрининге были установлены надлежащие стандарты данных и метаинформация, был проведен анализ в библиотеке из 640 одобренных FDA известных биоактивных соединений на влияние на прогрессирование инициации или разрешение гранулоцитарной воспалительной реакции. На основании наблюдаемых эффектов были классифицированы четыре типа иммуномодулирующих фенотипов, которые могут указывать на различные способы действия: противовоспалительные, антиразрешающие, провоспалительные и проразрешающие. 45 из 640 соединений оказывали значительное противовоспалительное действие, снижая исходный индекс воспаления до 50% или менее.

В этой категории было обнаружено шесть соединений, которые относились к фармакологическому классу добросовестных противовоспалительных препаратов. Подтверждая обоснованность этого подхода, после просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как фенотипический скрининг in vivo на иммуномодулирующую активность соединения может быть в значительной степени автоматизирован, что позволяет как последовательно собирать, так и анализировать данные в контексте всего животного.