Очистка и агрегации белка-предшественника амилоида внутриклеточного домена

Целью данной процедуры является очистка внутриклеточного домена белка-предшественника амилоида, также известного как A ICD, а также представление протокола термической агрегации и характеризации A ICD с помощью атомно-силовой микроскопии. Это достигается путем экспрессии слитого белка A GST из A ICD в бактериях. Затем белок G-S-T-A-I-C-D очищают и расщепляют тромбином для отделения GST от A ICD, после чего GST удаляют.

Затем индуцируют термическую агрегацию A ICD. Наконец, полученные агрегаты A ICD визуализируют с помощью атомно-силовой микроскопии. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие, что A ICD может быть очищен до гомогенного состояния в количестве, достаточном для биохимического и биофизического анализа.

Основное преимущество данного метода перед существующими способами, требующими сложных этапов хроматографии, заключается в том, что высокочистый и растворимый ICD может быть выделен непосредственно на лабораторном столе с использованием стандартных реагентов и оборудования. ICD, полученный по данному протоколу, пригоден для дальнейшего биохимического и биофизического анализа.

Процедуру продемонстрирует Амина ти. Бывший постдок моей лаборатории, доктор Андрес Оберер, покажет, как выполнять получение изображений A ICD с помощью атомно-силовой микроскопии. Для экспрессии рекомбинантного внутриклеточного домена A PP или A ICD начните с клеток BL 21, трансформированных вектором pgx 41, содержащим человеческий A ICD, слитый с C-концом GST; инокулируйте одну колонию в 10 миллилитров бульона LB с ампициллином и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при интенсивном перемешивании до следующего утра.

В колбе объемом один литр инкубируйте 400 миллилитров среды LB с ампициллином, добавив пять миллилитров ночной культуры. Инкубируйте при 37 °C при интенсивном перемешивании до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет 0,4–0,6. Обычно это занимает от двух до 2,5 часов; затем индуцируйте экспрессию G-S-T-A-I-C-D.

Добавьте 0,4 мМ IPTG и инкубируйте при 37 °C в течение пяти часов при интенсивном перемешивании. Центрифугируйте клетки при 6 000 ×g в течение 15 минут при 4 °C, после чего поместите осадок на хранение при -80 °C. После приготовления лизирующего буфера и охлаждения бактерий на льду добавьте 20 мл буфера к осадку и тщательно перемешайте, сочетая вортексирование с пипетированием на льду.

Ресуспендируйте бактериальный осадок и пропустите полученный бактериальный лизат через предварительно охлажденный гомогенизатор или французский пресс. При давлении 30,000 PSI пропустите лизат через гомогенизатор второй раз и соберите его в предварительно охлажденную пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте лизат при 15,000 ×g и 4 °C в течение 30 минут.

Отделите и перенесите супернатант в предварительно охлажденную пробирку объемом 50 мл. Добавьте 500 µL 50%-й суспензии глутатион-агарозы. Перемешивайте в ротаторе в течение 30 минут при температуре 4 °C.

После инкубации приготовьте свежий элюирующий буфер. Перенесите лизат и суспензию в одноразовую пятидюймовую полистирольную хроматографическую колонку с фильтрами с крупными порами. Промойте колонку пять раз 3 мл PBS.

Закройте нижнюю часть колонки заглушкой и добавьте 500 µL элюирующего буфера комнатной температуры. Закройте верхнюю часть колонки и вращайте ее в течение пяти минут при комнатной температуре. Соберите первую порцию элюата в охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Повторите элюцию еще дважды. Диализируйте элюат с использованием диализной мембраны с пределом отсечения 10 000 Да в четырех литрах PBS в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день проведите диализ в дополнительных четырех литрах PBS при температуре 4 °C в течение одного часа.

Извлеките белок из диализного кассета и проведите анализ для количественного определения белка, чтобы установить выход G-S-T-A-I-C-D. Типичная очистка из 400 milliliters культуры позволяет получить более 20 milligrams очищенного белка с концентрацией от 10 до 20 milligrams per milliliter. Разделите белок на аликвоты по 200 microliter и заморозьте при температуре minus 80 degrees Celsius.

Для отделения A ICD от GST добавьте 20 µL тромбина в концентрации 1 unit/µL к 200 µL очищенного G-S-T-A-I-C-D и инкубируйте смесь в течение ночи при 37 °C. На следующий день удалите все агрегированные материалы путем центрифугирования при 20,000 ×g в течение 30 минут при 4 °C. Перенесите супернатант в предварительно охлажденную микропробирку для удаления GST и тромбина. Добавьте 50 µL 50%-й суспензии глутатион-агарозы и 50 µL 50%-й суспензии p-Wino-заино-агарозы соответственно.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут при перемешивании. Кратковременно центрифугируйте для осаждения агробидов и перенесите супернатант в новую пробирку. Повторите экстракцию GST глутатионом еще четыре раза.

Проведите количественный анализ белка в 5 µL очищенного A ICD. Типичный выход из 400 мл культуры составляет от 50 до 100 µg при концентрации от 0.2 до 0.5 mg/mL. После разведения свежеприготовленного A ICD в PBS до концентрации 0.1 mg/mL индуцируйте термическую агрегацию путем инкубации образцов при 43 °C и 800 RPM в термошейкере в течение 48 часов.

Разбавьте образец деионизированной водой в 20 раз и нанесите два микролитра на свежесколотый слюдяной подложку. Высушите образец в эксикаторе в течение ночи для визуализации агрегатов A ICD. Используйте атомно-силовую микроскопию в режиме постукивания с кантилеверами из нитрида циркония с золотым напылением и номинальным радиусом кончика 2 нм.

Типичные амплитуды постукивания при получении изображений составляют от 10 до 20 nanometers на резонансной частоте кантилеверов. Здесь показаны экспрессия и относительное обогащение G-S-T-A-I-C-D. После лизиса большая часть слитого белка находится в растворимой фракции, поэтому экстракция из телец включения не требуется.

Материал, элюированный с колонки с глутатионом, обладает чистотой более 95%. В представленной подготовке концентрация белка, элюированного с колонки, составляла 14,5 mg/mL, а выход составил 22 mg. Расщепление 200 µL данной подготовки в течение ночи с использованием 20 единиц тромбина привело к почти 100% расщеплению химерного белка.

Количество используемого тромбина слишком мало, чтобы его можно было обнаружить с помощью красителя Кумаси. Синее окрашивание, удаление тромбина и GST привели к некоторой потере материала. Тем не менее, чистота составила более 90%, а выход в данной подготовке составил 70 µg A ICD при концентрации 0.35 mg/mL.

Агрегаты ICD, визуализированные с помощью АСМ, обычно представляют собой стероидные аморфные структуры размером от 50 до 100 нанометров. Агрегированный материал не обнаруживается при добавлении эквимолярного количества шаперона UBI Quillin 1 в реакцию агрегации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как очищать EICD, индуцировать его агрегацию и визуализировать агрегаты EICD с помощью АСМ.

Материалы, очищенные данным методом, могут быть использованы в других методах, таких как анализ светорассеяния и анализ с использованием фильтрующих ловушек, для изучения влияния молекулярных шаперонов на агрегацию EACD.