Очистка и агрегации белка-предшественника амилоида внутриклеточного домена

Целью этой процедуры является очистка внутриклеточного домена-предшественника амилоида, также известного как А ИКД, и представление протокола для термической агрегации и характеризации А ИКД с помощью атомно-силовой микроскопии. Это достигается путем первичной экспрессии A GST слияния A ICD у бактерий. Затем белок G-S-T-A-I-C-D очищают, расщепляют тромбином для отделения GST от ICD А, и GST удаляют.

Затем индуцируется тепловая агрегация ИКД. Наконец, агрегаты A ICD визуализируются с помощью атомно-силовой микроскопии. В конечном итоге можно получить результаты, показывающие, что ИКД А может быть очищен до однородности в количестве, достаточном для биохимического и биофизического анализа.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, требующими сложных этапов хроматографии, заключается в том, что она является высокочистой и растворимой. ИКД может быть изолирован на столе с помощью стандартных реагентов и оборудования. МКБ, полученная по этому протоколу, пригодна для дальнейшей биохимической и биофизической характеристики.

Демонстрировать процедуру будет Амина ти. Бывший постдок моей лаборатории, доктор Андрес Оберер, продемонстрирует, как выполнить атомно-силовую микроскопическую визуализацию ИКД А для экспрессии рекомбинантного внутриклеточного домена А РР или ИКД. Начните с клеток BL 21, трансформированных с помощью вектора pgx 41, в котором находится человеческая А ИКД, слитая с С-концом GST с одной колонией, инокулируйте 10 миллилитров бульона LB ампициллином и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с энергичным встряхиванием на следующее утро.

Инкубируйте 400 миллилитров LB ампициллина в литровой колбе с пятью миллилитрами ночной культуры. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с энергичным встряхиванием до тех пор, пока оптическая плотность на 600 нанометрах не достигнет 0,4–0,6. Обычно это занимает от двух до 2,5 часов, чтобы вызвать экспрессию G-S-T-A-I-C-D.

Мы добавляем 0,4 миллимоляра IPTG и инкубируем при температуре 37 градусов Цельсия с энергичным встряхиванием в течение пяти часов. Центрифугируйте ячейки при температуре 6 000 раз G в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия и храните гранулу при температуре минус 80 градусов Цельсия. После приготовления лизиса, буферизации и бросания бактерий на лед добавьте 20 миллилитров буфера в гранулу и с помощью комбинации вортексирования и таирования на льду с помощью пипетки тщательно проработайте.

Суспензия бактериальной гранулы Риза пропускает суспензию бактериального лизата Риза через предварительно охлажденный эмульгатор или френч-пресс. При давлении 30 000 фунтов на квадратный дюйм пропустите лизат через эмульгатор второй раз и соберите лизат в предварительно охлажденную 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте лизат с температурой 15 000 раз G и четырьмя градусами Цельсия в течение 30 минут.

Отделите и переложите супинат в предварительно охлажденную 50 миллилитровую трубку. Добавьте 500 микролитров 50%-ной суспензии возникшего глутатиона. Вращайте в течение 30 минут со скоростью четыре градуса Цельсия, пока образец вращается.

Сделайте свежий буфер для элюирования после инкубации. Залить лизат и суспензию в одноразовую пятидюймовую полистирольную хроматографическую колонку с курсовыми фильтрами. Промойте колонку пять раз тремя миллилитрами PBS.

Закупорьте нижнюю часть колонки крышкой и добавьте 500 микролитров буфера комнатной температуры. Закройте верхнюю часть колонны крышкой и поворачивайте в течение пяти минут комнатной температуры. Соберите ранний вес в охлажденную микропробирку для мусора объемом 1,5 миллилитров.

Повторите вымывание еще два раза. Диализуйте элюат в диализной мембране с отсечкой молекулярной массы 10 000 в четырех литрах PBS в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день. Диализируйте против дополнительных четырех литров PBS при четырех градусах Цельсия в течение одного часа.

Извлеките белок из диализной кассеты и проведите количественное определение белка для определения выхода G-S-T-A-I-C-D. Типичная очистка от 400 миллилитров культуры приведет к получению более 20 миллиграммов очищенного белка при концентрации от 10 до 20 миллиграммов на миллилитр. Аликвотируйте белок в 200 микролитров, аликвоты, и заморозьте до минус 80 градусов по Цельсию.

Чтобы освободить ИКД А от оттаивания GST, 200 микролитров очищенного G-S-T-A-I-C-D и добавить 20 микровысвобождений по одной единице на микролитр тромбина инкубируют в течение ночи при 37 градусах Цельсия на следующий день, очистите любой агрегированный материал центрифугированием при 20 000 умноженных на G в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Перенесите СУПИНАТ в предварительно охлажденную микропробирку, чтобы удалить GST и тромбин. Добавьте 50 микролитров суспензии 50% глутатиона и 50 микролитров, 50% p и суспензии wino zaine aro соответственно.

Инкубировать с вращением в течение пяти минут комнатной температуры. Центрифугой ненадолго отсадите агрошарики и удалите супинат в свежую пробирку. Экстрагируйте GST еще четыре раза с глутатионом.

Aros проводит количественное определение белка на пяти микролитрах очищенного А МКБ. Типичный урожай с культуры объемом 400 миллилитров составляет от 50 до 100 микрограмм при концентрации от 0,2 до 0,5 миллиграмма на миллилитр. После разбавления свежеприготовленного A ICD в PBS до концентрации 0,1 мг на миллилитр индуцируется термическая агрегация путем инкубации образцов при температуре 43 градуса Цельсия при 800 об/мин в нагретом шейкере в течение 48 часов.

Разбавьте образец в 20 раз деионизированной водой и нанесите два микролитра на свежерасщепленную воду. Слюда сушит образец в адгезивной жидкости в течение ночи, чтобы визуализировать агрегированный А ИКД, использует атомно-силовую микроскопию в режиме постукивания с золотым козлом. Консоли Micro sharpp nitride с номинальным радиусом наконечника два нанометра.

Типичные амплитуды постукивания при визуализации, от 10 до 20 нм на резонансной частоте консолей. Здесь показано выражение и относительное обогащение G-S-T-A-I-C-D. После лизиса большая часть белка-сплава присутствует в растворимой фракции, в связи с чем экстракция из тел включения не требуется.

Материал, на который ссылается столбик с образованием глутатиона, имеет чистоту более 95%. В показанном здесь препарате концентрация белка, указанная в столбце, составляла 14,5 миллиграммов на миллилитр, а выход – 22 миллиграмма. Расщепление 200 микролитров этого препарата в течение ночи с 20 единицами тромбина привело к почти 100% расщеплению гибридного белка.

Количество используемого тромбина достаточно низкое, чтобы его нельзя было обнаружить кумаси. Окрашивание в синий цвет, удаление тромбина и налога на товары и услуги приводили к некоторым потерям материала. Тем не менее, его чистота была более 90% с выходом в этом препарате 70 микрограммов А МКД в концентрации 0,35 миллиграмма на миллилитр.

Агрегаты ИКД, визуализируемые с помощью FM, обычно являются стероидными аморфными и имеют размер от 50 до 100 нанометров. Агрегированный материал не обнаруживается при добавлении эквимолярного количества шаперона UBI Quillin one в реакцию агрегации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очистить EICD, индуцировать его агрегацию и изображение агрегата bay A-F-M-E-I-C-D.

«Очищенный» с помощью этого метода может быть применен к другим методам, таким как рассеяние света и анализы фильтров-ловушек, чтобы ответить на вопросы, касающиеся влияния молекулярных шаперонов на агрегацию EACD.