Выделение ядер кардиомиоцитов с Посмертные тканей

Общая цель данной процедуры заключается в выделении ядер кардиомиоцитов из посмертной ткани. Это достигается путем первоначальной гомогенизации ткани с помощью зондового гомогенизатора и стеклянного пестика с последующими этапами фильтрации. Вторым этапом является выделение ядерной фракции из других клеточных фракций методом центрифугирования с осаждением по плотности.

Затем ядра кардиомиоцитов иммуномаркируют антителами к PCM1. Заключительным этапом является выделение маркированных ядер кардиомиоцитов с помощью сортинга клеток с флуоресцентной активацией. В итоге, непосредственно перед дальнейшими манипуляциями, чистота ядер кардиомиоцитов подтверждается повторным анализом отсортированных ядерных фракций.

Основное преимущество данного метода заключается в том, что ядра кардиомиоцитов могут быть проанализированы с одинаково высоким качеством как из свежих, так и из замороженных архивных тканей в высокопроизводительном режиме. Исследования на основе ДНК в кардиомиоцитах особенно затруднены по нескольким причинам. Во-первых, кардиомиоциты составляют лишь около 20–30% всех клеток сердца.

Более того, они в значительной степени имеют ядра. Кроме того, кардиомиоциты в значительной степени полиплоидны. Описываемый здесь метод позволяет преодолеть все эти трудности.

Перед началом процедуры покройте пробирки для ультрацентрифуги 10 миллилитрами раствора для покрытия, состоящего из 1% BSA и PBS. После вращения пробирок в течение 30 минут удалите раствор для покрытия и дайте им высохнуть на воздухе.

Начните процедуру выделения ядер сердечной ткани, используя скальпель для препарирования левого желудочка из мгновенно замороженного сердца мыши. Разрежьте препарированный образец на небольшие сегменты, затем перенесите фрагменты ткани в коническую пробирку объемом 50 мл, заполненную 15 мл лизирующего буфера. Затем гомогенизируйте ткань сердца с помощью гомогенизатора с погружным зондом при 24 000 об/мин в течение 10 секунд, после чего разбавьте гомогенат равным объемом лизирующего буфера до 30 мл. Перенесите гомогенат в стеклянный гомогенизатор и проведите восемь движений пестиком с большим зазором для высвобождения ядер.

Затем профильтруйте неочищенные ядра. Сначала пропустите их через клеточный фильтр с порами 100 мкм, затем через клеточный фильтр с порами 70 мкм в новый конический пробирку объемом 50 мл. Теперь центрифугируйте полученный изолят неочищенных ядер в течение 10 минут при 700 ×g и температуре 4 °C.

Переверните пробирку, чтобы аккуратно удалить супернатант, затем протрите внутреннюю поверхность пробирки бумажным полотенцем. Будьте осторожны, чтобы не повредить осадок ядер. Несколько раз прокачайте раствор пипеткой, чтобы ресуспендировать грубый препарат ядер.

Ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах сахарозного буфера, затем добавьте к суспензии ядер еще 25 миллилитров сахарозного буфера. Далее добавьте 10 миллилитров свежеприготовленного сахарозного буфера в одну из предварительно подготовленных покрытых пробирок для ультрацентрифугирования. Затем осторожно нанесите раствор ресуспендированного осадка ядер поверх буфера.

После балансировки пробирок в свободноподвижном роторе поместите ротор в высокоскоростную центрифугу и центрифугируйте образец ядер в течение 60 минут при 13 000 ×g и четырех градусах Цельсия. По завершении центрифугирования осторожно извлеките пробирки из ротора и снова переверните их. Чтобы удалить супернатант, протрите внутреннюю поверхность пробирки бумажным полотенцем, удаляя остатки содержимого, как и прежде, затем ресуспендируйте осадок ядер в одном миллилитре буфера для хранения ядер.

Перед началом процедуры иммуноокрашивания перенесите аликвоту образца ядер объемом 20 µL в пробирку типа «Эппендорф». Добавьте к аликвоте 980 µL буфера для хранения ядер и маркируйте пробирку как «отрицательный контроль». Теперь добавьте антитела anti PCM one в пробирку с образцом ядер и в пробирку с отрицательным контролем в разведении 1:500.

Затем инкубируйте обе пробирки при температуре four degrees Celsius в течение ночи. На следующий день, после промывки пробирок буфером для хранения ядер и удаления супернатанта, ресуспендируйте осадок ядер в другом миллилитре буфера для хранения ядер.

Затем добавьте к образцам клеток флуоресцентную вторичную антитело против кролика в разведении 1:100 и инкубируйте их при температуре 4 °C в течение одного часа. После промывки пробирок буфером для хранения ядер повторно суспендируйте осадки в 1 мл буфера для хранения ядер для последующего проточного цитометрического сортинга и анализа; после обработки пробирок для сбора ядер BSA и PBS, как в начале видео, начните с фильтрации образца и отрицательного контроля через индивидуальные клеточные фильтры с размером пор 30 мкм. Непосредственно перед загрузкой добавьте краситель ДНК.

Выполните разведение 1:500 для идентификации популяций ядер. Загрузите отрицательный контроль в проточный цитометр. Используйте параметры прямого и бокового светорассеяния для установки первого гейта с целью определения ядер кардиомиоцитов, аналогично представленному здесь DOT-графику.

Затем используйте параметры прямого светорассеяния и ширины импульса прямого светорассеяния для создания второго гейта вокруг синглетов ядер, аналогично представленному здесь DOT-графику. Теперь загрузите иммуномаркированный образец и установите третий гейт для дифференциации положительных по PCM1 ядер кардиомиоцитов от отрицательных по PCM1 ядер некардиомиоцитов. Используйте краситель для ядерной ДНК для анализа содержания ДНК и проведения анализа клеточного цикла, аналогично анализу, проиллюстрированному данной гистограммой.

После сортировки ядер на основе их позитивности по PCM1 поместите отсортированные ядра на лед и повторно проанализируйте аликвоту каждого отсортированного образца для определения чистоты сортировки. В завершение центрифугируйте отсортированные ядра в пробирках для сбора в течение 15 минут при 1500 ×g и четырех градусах Цельсия. После удаления супернатантов ресуспендируйте осадки ядер в буфере, совместимом с выбранным последующим применением.

На этом первом рисунке сердце взрослой мыши было окрашено ядерным красителем и антителами к PCM1, фактору транскрипции сердца NKX2.5 и тяжелой цепи миозина (MHC). Здесь представлено увеличенное изображение совмещения каналов с предыдущего рисунка. Обратите внимание, что ядра, помеченные PCM1 белым цветом, экспрессируют фактор транскрипции NKX2.5 красным цветом и окружены цитоплазмой кардиомиоцитов зеленого цвета.

Эти данные в совокупности демонстрируют точность, с которой окрашивание на PCM one позволяет идентифицировать ядра кардиомиоцитов. На врезке показан эпинуклеарный характер окрашивания PCM one в ядрах миоцитов, на что также указывают стрелки в эксперименте, представленном на следующих трех рисунках; изолированные ядра сердечных клеток были окрашены красителем ДНК DRAC five и антителами к PCM one. Здесь, на совмещенном изображении двух предыдущих рисунков, стрелки снова указывают на эпинуклеарный характер окрашивания PCM one в изолированных ядрах кардиомиоцитов.

Эта точечная диаграмма демонстрирует, что примерно 30% ядер, выделенных данным методом, являются ядрами кардиомиоцитов, что подтверждается их маркировкой PCM one. Наконец, как показывают эти гистограммы, ядра кардиомиоцитов мыши преимущественно диплоидны, на что указывает пик 2N, и только небольшая часть является тетраплоидной, что видно по более низкому пику 4N. Одним из преимуществ этого метода является возможность его легкой адаптации для других видов.

Как и у людей.