ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы выражаем свою признательность Marcelo Торо за помощь с проточной цитометрии. Работа выполнена при поддержке шведского сердца и легких фонда, Комиссии ЕС FP7 &quot;CardioCell&quot; Шведский исследовательский совет, AFA страхования и ALF. Б. был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Выделение сердечного ядра <ol><li> Пальто ультрацентрифуге труб (Beckman пробирок # 363664) с 10 мл 1% BSA / PBS покрытие решение. Закройте трубы, и пусть они вращаются в течение 30 минут в трубке ротатора. Удалите покрытие решение, и пусть пробирок воздух сухой (одна трубка в сердце мыши требуется для анализа одного сердца мыши, поочередно до 5 сердца мыши или 1 г ткани сердца от различных видов (например, человека) может быть обработан в одной трубке). </li><li> Все последующие шаги должны быть выполнены на льду. Проанализируйте левого желудочка из свежих или замороженных оснастки мышь сердца с помощью скальпеля. Обратите внимание, что данный протокол оптимизирован для мыши сердце, но также может быть адаптирована к крысе или человеческое сердце. Кроме того, использовать до 1 г ткани сердца от различных видов. </li><li> Обрежьте образца на маленькие ячейки с помощью скальпеля. </li><li> Передача части ткани в 50 мл Сокол трубки, заполненной 15 мл лизис буфера. </li><li> Однородныйткани сердца с Т-25 Ultra-Turrax зонд гомогенизатор (IKA) на 24 000 оборотов в минуту на 10 секунд. </li><li> Развести гомогената с равным объемом лизис буфера до 30 мл. </li><li> Использование стекла douncer (40 мл) для дальнейшего гомогенизации ткани и свободные ядра. Выполнять восемь ударов с большим пестиком оформления. </li><li> Передайте сырой ядер изоляции через 100 мкм и 70 мкм нейлоновая сетка ячейка фильтр (BD Biosciences), последовательно. </li><li> Спином вниз сырой ядер изолировать в охлажденном центрифуги (4 ° С) при 700 мкг в течение 10 мин. </li><li> Удаляют супернатант тщательно обращения трубки и вытрите трубки с бумажным полотенцем. Будьте осторожны, чтобы не нарушить ядра гранулы. </li><li> Растворите сырой ядер изолировать в 5 мл сахарозы буфера с помощью пипетки раствор несколько раз вверх и вниз. Добавьте еще 25 мл сахарозы буфер растворенных гранул. </li><li> Добавить 10 мл свежеприготовленного сахарозы буфер покрытием труб ультрацентрифуге (см. п. 1.1). &lt;/ LI&gt; <li> Аккуратно наложить добавляют 10 мл буфера с сахарозой ресуспендированного ядра гранулы растворяются в сахароза буфера, начиная с шага 1.9. </li><li> Баланс пробирок перед помещением их в JS13.1 бесплатно размахивая ротора и поместить ротор в высокоскоростной центрифуге (Beckman Avanti S-25). </li><li> Спин ядра образца при 13000 х г при 4 ° С в течение 60 мин. </li><li> Когда спина завершено, удалить трубы тщательно от ротора и отказаться от супернатант обращения трубы и уничтожить оставшихся обломков от внутренней поверхности трубы с бумажным полотенцем. </li><li> Растворите гранулы ядер в 1 мл буфера хранения ядра (NSB плюс буфер). Примечание: NSB также содержит 1,5 мМ спермина как ДНК-стабилизатор. </li><li> Перейдите к шагу 2.1, иммунной ядер кардиомиоцитов. </li></ol> 2. Иммуноокрашивание для проточной цитометрии <ol><li> Подготовка отрицательного контроля для иммунной. Возьмите аликвоту 20 мкл из ядер образца идд 980 мкл NSB плюс буфера. </li><li> Добавить анти-pericentriolar материала 1 антител (кролик анти-PCM-1, Атлас антитела) с ядрами образца в разведении 1:500 до immunolabel ядер кардиомиоцитов. Добавить изотипа антител в том же разведении как анти-PCM-1 антитела к отрицательным контролем, подготовленный в шаге 2.1. </li><li> Инкубируйте отрицательного контроля и пробирку при 4 ° С в течение ночи. </li><li> Вымойте отрицательного контроля и образцов по крайней мере, один раз с NSB плюс буфер (спин вниз трубы в охлажденном центрифуги (4 ° С) при 700 мкг в течение 10 минут. Удалить супернатант и растворить ядер гранул в 1 мл NSB плюс буфер). </li><li> Добавить анти-кролик люминесцентные вторичными антителами (FITC или APC) для отрицательного контроля и пробирку в разведении 1:1000. </li><li> Инкубируйте отрицательного контроля и пробирку при 4 ° С в течение 1 часа. </li><li> Вымойте отрицательного контроля и образцов по крайней мере, один раз с NSB плюс буфер (спин вниз трубы в охлажденном центрифуги (4 ° С) при 700 мкг в течение 10 минут. Удалить супернатант и растворить ядер гранул в 1 мл NSB плюс буфер). </li><li> Приступить к проточной цитометрии и сортировки. </li></ol> 3. Проточной цитометрии <ol><li> Пальто ядер коллекции труб (Falcon 15 мл) с 1% BSA / PBS решение, прежде чем начать проточной цитометрии сортировки, как описано в пункте 1.1. </li><li> Фильтр образца и отрицательного контроля через 30 мкм фильтр клетки и загрузить сначала отрицательного контроля в проточной цитометрии (BD приток). Определение первых и вторых ворот для определения ядер и фуфайки (одного ядра), основанный на рассеяние вперед (FSC), длительность импульса вперед разброс (FS ширины импульса) и боковых рассеяния (SSC) (рис. 2, б). Добавление ДНК пятна (DRAQ5 (1:500)) в образце может помочь выявить ядер населения на начальном этапе. </li><li> Загрузите immunolabeled образца и определить третьи ворота, чтобы изолировать ядер кардиомиоцитов (PCM-1-positve) от не-ядер кардиомиоцитов (PCM-1-отрицательный). Начать сортировку(Рис. 2, г). </li></ol> Дополнительно: Для того, чтобы проанализировать содержание ядерной ДНК (плоидности) и проводить анализ клеточного цикла добавить соответствующие ДНК пятна с ядрами (например, Hoechst 33342 или DRAQ5) (рис. 2д). <ol start="4"><li> После того, как поток сортировки цитометрии, поместите ядер на льду и повторный анализ, чтобы определить чистоту сортировки (рис. 3а, б). </li><li> Спином вниз отсортированы ядер в коллекции труб в 1500 мкг в охлажденном центрифуги в течение 15 мин. </li><li> Растворите гранулы ядер в буфере совместим с приложением вниз по течению. </li></ol> 4. Представитель Результаты Морфология ядра и целостности могут быть оценены с помощью ДНК пятна и визуализированы с помощью микроскопа (рис. 1). Успешное PCM-1 маркировка может быть оценена эпифлуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии (рис. 1 и рис. 2в, г). PCM-1-positiве и отрицательные население должно быть хорошо отделены друг от друга (рис. 2, г). В мышиной левого желудочка около 30% всех ядер должно быть ядер кардиомиоцитов (рис. 2). Сортировка чистоты могут быть оценены путем повторного анализа отсортированы ядер (рис. 3а, б). Оба ядра популяции должны сортировки чистотой более 95%. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> Рисунок 1. PCM-1 определяет ядер кардиомиоцитов. Сердечная ядер (а) окрашивали антителами к PCM-1 (б) и Nkx2.5 (с) во взрослом сердце мыши. (Г) PCM-1-меченых ядер кардиомиоцитов окружении цитоплазмы (тяжелой цепи миозина (MHC)) и выразить транскрипционный фактор Nkx2.5, документально точной идентификации ядер кардиомиоцитов на PCM-1 окрашивания (масштаб баров 20 мкм и 10 мкм (г, вставка)). (Е) Сердечная изолятов ядер визуализированы с ДНК пятна DRAQ5. (Е, ж) Cardiomyocyte ядер, меченных антител против PCM-1 (линейки 10 мкм). Обратите внимание, что шаблон epinuclear окрашивания PCM-1 в ядрах миоцитов в тканях раздел и в изолированных ядрах (стрелки). <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> Рисунок 2. Проточной цитометрии сортировка ядер кардиомиоцитов. (А) Сердечная ядер определяются вперед рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). (Б) вторые ворота определяет единый ядер FSC и FS длительность импульса 5. (C, D) Флуоресцентные стробирования позволяет разделение ядер кардиомиоцитов (PCM-1-положительных) и не кардиомиоцитов (PCM-1-отрицательная) ядер из ткани сердца. (Е) Мышь кардиомиоцитов в основном (&gt; 80%) диплоидный (2п), лишь небольшое подмножество тетраплоидных (4л) 6. Обратите внимание, что человеческие кардиомиоциты содержат более высокой частоте полиплоидии ядер (&gt; 2п) 7,8. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <stroнг&gt; Рисунок 3. Чистота анализа отсортированы кардиомиоцитов и не ядер кардиомиоцитов. Повторный анализ отсортированных без кардиомиоцитов (а) и ядер кардиомиоцитов (б). Обе популяции показать сортировки чистотой более 99%.

<ol><li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li>
<li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li>
<li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content%2C+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li>
<li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content%2C+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts%3A+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li>
<li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li>
<li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li>
<li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2-5%28eGFP%2Fw%29+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li>
<li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28(2009).</li>
<li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li>
<li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li>
<li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914(2008).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Точная идентификация ядер кардиомиоцитов имеет решающее значение для анализа регенеративных процессов в миокарде 2,3. Обычные методы, чтобы изолировать кардиомиоцитов из свежей ткани в основном на основе ферментативного переваривания белки внеклеточного матрикса и последующей очистки от интерстициальных клеток низкой скорости центрифугирования. Дальнейшая очистка живых кардиомиоцитов из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) могут быть выполнены с immunolabeling поверхностных маркеров, таких как Сирпа 9</s...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Лизирующего буфера </td></tr><tr><td> Название реагента </td></tr><tr><td> 0,32 М сахарозы </td></tr><tr><td> 10 мМ Трис-HCl (рН = 8) </td></tr><tr><td> 5 мМ CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 мМ ацетат магния </td></tr><tr><td> 2,0 мМ ЭДТА </td></tr><tr><td> 0,5 мМ EGTA </td></tr><tr><td> 1 мМ DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 2. Сахароза буфер </td></tr><tr><td> Название реагента </td></tr><tr><td> 2,1 М сахарозы </td></tr><tr><td> 10 мМ Трис-HCl (рН = 8) </td></tr><tr><td> 5 мМ ацетат магния </td></tr><tr><td> 1 мМ DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 3. Ядер хранения буфера (NSB плюс) </td></tr><tг&gt; <td> Название реагента </td></tr><tr><td> 0,44 М сахарозы </td></tr><tr><td> 10 мМ Трис-HCl (рН = 7,2) </td></tr><tr><td> 70 мМ KCl </td></tr><tr><td> 10 мМ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1,5 мМ спермина </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Реактивы и оборудование </td><td> Компания </td></tr><tr><td> Изотип кролика IgG-CHIP класса, # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> Кролик анти-PCM-1 антител, # HPA023374 </td><td> Атлас Антитела </td></tr><tr><td> Осел сек. антитела, анти-кролик Alexa Fluor 488, #-21206 или эквивалент сек. флуоресцентных антител </td><td> Life Technologies </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> ячейки сита 30 мкм, 70 мкм и 100 мкм </td><td> BD Biosciences </td></tr><tr><td> Стекло douncer (40 мл) ипестик &quot;L&quot; </td><td> VWR (Уитон Industries Inc) </td></tr><tr><td> Т-25 Ultra-Turrax Гомогенизатор </td><td> IKA Германии </td></tr><tr><td> Диспергирование инструмент S25 N-18 G </td><td> IKA Германии </td></tr><tr><td> Бекман Avanti центрифуги </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Сокол трубы 15 мл и 50 мл </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Бекман пробирок # 363664 </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> JS13.1 свободного качания ротора </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Приток цитометр </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Труба Rotator </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

Выделение ядер кардиомиоцитов с Посмертные тканей

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Идентификация ядер кардиомиоцитов была сложной в срезах тканей большинство стратегий полагаться только на цитоплазматических белков-маркеров 1. Редкие события в кардиомиоциты, таких как пролиферации и апоптозе требуют точной идентификации сердечных миоцитов ядер для анализа клеточного обновления в гомеостаза и при патологических состояниях 2. Здесь мы предлагаем метод, чтобы изолировать ядер кардиомиоцитов из тканей после смерти путем осаждения и плотность immunolabeling с антителами против pericentriolar материала 1 (PCM-1) и последующая сортировка проточной цитометрии. Эта стратегия обеспечивает высокую пропускную способность и анализ изоляцией с преимуществом работы одинаково хорошо на свежем ткани и замороженных архивных материалов. Это позволяет изучать материалы уже собраны в биобанках. Этот метод применим и испытан в широком диапазоне видов и пригодны для нескольких ниже приложений, таких как углерод-14 знакомства 3, клетка-суCLE анализа 4, визуализация тимидина аналогов (например, BrdU и ПИН) 4, транскриптом и эпигенетических анализа.

Сердечная ядра изолированы с помощью осаждения и плотность immunolabeled с антителами против pericentriolar материал 1 (PCM-1) определить и сортировать ядер кардиомиоцитов с помощью проточной цитометрии.

Идентификация ядер кардиомиоцитов в срезах тканей представляла собой сложную задачу, поскольку большинство стратегий опирались исключительно на цитоплазматические маркерные белки1. Редкие события ...

Общая цель данной процедуры заключается в выделении ядер кардиомиоцитов из посмертной ткани. Это достигается путем первоначальной гомогенизации ткани с помощью зондового гомогенизатора и стеклянного пестика с последующими этапами фильтрации. Вторым этапом является выделение ядерной фракции из других клеточных фракций методом центрифугирования с осаждением по плотности.Затем ядра кардиомиоцитов иммуномаркируют антителами к PCM1. Заключительным этапом является выделение маркированных ядер кардиомиоцитов с помощью сортинга клеток с флуоресцентной активацией. В итоге, непосредственно перед дальнейшими манипуляциями, чистота ядер кардиомиоцитов подтверждается повторным анализом отсортированных ядерных фракций.Основное преимущество данного метода заключается в том, что ядра кардиомиоцитов могут быть проанализированы с одинаково высоким качеством как из свежих, так и из замороженных архивных тканей в высокопроизводительном режиме. Исследования на основе ДНК в кардиомиоцитах особенно затруднены по нескольким причинам. Во-первых, кардиомиоциты составляют лишь около 20–30% всех клеток сердца.Более того, они в значительной степени имеют ядра. Кроме того, кардиомиоциты в значительной степени полиплоидны. Описываемый здесь метод позволяет преодолеть все эти трудности.Перед началом процедуры покройте пробирки для ультрацентрифуги 10 миллилитрами раствора для покрытия, состоящего из 1% BSA и PBS. После вращения пробирок в течение 30 минут удалите раствор для покрытия и дайте им высохнуть на воздухе.Начните процедуру выделения ядер сердечной ткани, используя скальпель для препарирования левого желудочка из мгновенно замороженного сердца мыши. Разрежьте препарированный образец на небольшие сегменты, затем перенесите фрагменты ткани в коническую пробирку объемом 50 мл, заполненную 15 мл лизирующего буфера. Затем гомогенизируйте ткань сердца с помощью гомогенизатора с погружным зондом при 24 000 об/мин в течение 10 секунд, после чего разбавьте гомогенат равным объемом лизирующего буфера до 30 мл. Перенесите гомогенат в стеклянный гомогенизатор и проведите восемь движений пестиком с большим зазором для высвобождения ядер.Затем профильтруйте неочищенные ядра. Сначала пропустите их через клеточный фильтр с порами 100 мкм, затем через клеточный фильтр с порами 70 мкм в новый конический пробирку объемом 50 мл. Теперь центрифугируйте полученный изолят неочищенных ядер в течение 10 минут при 700 ×g и температуре 4 °C.Переверните пробирку, чтобы аккуратно удалить супернатант, затем протрите внутреннюю поверхность пробирки бумажным полотенцем. Будьте осторожны, чтобы не повредить осадок ядер. Несколько раз прокачайте раствор пипеткой, чтобы ресуспендировать грубый препарат ядер.Ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах сахарозного буфера, затем добавьте к суспензии ядер еще 25 миллилитров сахарозного буфера. Далее добавьте 10 миллилитров свежеприготовленного сахарозного буфера в одну из предварительно подготовленных покрытых пробирок для ультрацентрифугирования. Затем осторожно нанесите раствор ресуспендированного осадка ядер поверх буфера.После балансировки пробирок в свободноподвижном роторе поместите ротор в высокоскоростную центрифугу и центрифугируйте образец ядер в течение 60 минут при 13 000 ×g и четырех градусах Цельсия. По завершении центрифугирования осторожно извлеките пробирки из ротора и снова переверните их. Чтобы удалить супернатант, протрите внутреннюю поверхность пробирки бумажным полотенцем, удаляя остатки содержимого, как и прежде, затем ресуспендируйте осадок ядер в одном миллилитре буфера для хранения ядер.Перед началом процедуры иммуноокрашивания перенесите аликвоту образца ядер объемом 20 µL в пробирку типа «Эппендорф». Добавьте к аликвоте 980 µL буфера для хранения ядер и маркируйте пробирку как «отрицательный контроль». Теперь добавьте антитела anti PCM one в пробирку с образцом ядер и в пробирку с отрицательным контролем в разведении 1:500.Затем инкубируйте обе пробирки при температуре four degrees Celsius в течение ночи. На следующий день, после промывки пробирок буфером для хранения ядер и удаления супернатанта, ресуспендируйте осадок ядер в другом миллилитре буфера для хранения ядер.Затем добавьте к образцам клеток флуоресцентную вторичную антитело против кролика в разведении 1:100 и инкубируйте их при температуре 4 °C в течение одного часа. После промывки пробирок буфером для хранения ядер повторно суспендируйте осадки в 1 мл буфера для хранения ядер для последующего проточного цитометрического сортинга и анализа; после обработки пробирок для сбора ядер BSA и PBS, как в начале видео, начните с фильтрации образца и отрицательного контроля через индивидуальные клеточные фильтры с размером пор 30 мкм. Непосредственно перед загрузкой добавьте краситель ДНК.Выполните разведение 1:500 для идентификации популяций ядер. Загрузите отрицательный контроль в проточный цитометр. Используйте параметры прямого и бокового светорассеяния для установки первого гейта с целью определения ядер кардиомиоцитов, аналогично представленному здесь DOT-графику.Затем используйте параметры прямого светорассеяния и ширины импульса прямого светорассеяния для создания второго гейта вокруг синглетов ядер, аналогично представленному здесь DOT-графику. Теперь загрузите иммуномаркированный образец и установите третий гейт для дифференциации положительных по PCM1 ядер кардиомиоцитов от отрицательных по PCM1 ядер некардиомиоцитов. Используйте краситель для ядерной ДНК для анализа содержания ДНК и проведения анализа клеточного цикла, аналогично анализу, проиллюстрированному данной гистограммой.После сортировки ядер на основе их позитивности по PCM1 поместите отсортированные ядра на лед и повторно проанализируйте аликвоту каждого отсортированного образца для определения чистоты сортировки. В завершение центрифугируйте отсортированные ядра в пробирках для сбора в течение 15 минут при 1500 ×g и четырех градусах Цельсия. После удаления супернатантов ресуспендируйте осадки ядер в буфере, совместимом с выбранным последующим применением.На этом первом рисунке сердце взрослой мыши было окрашено ядерным красителем и антителами к PCM1, фактору транскрипции сердца NKX2.5 и тяжелой цепи миозина (MHC). Здесь представлено увеличенное изображение совмещения каналов с предыдущего рисунка. Обратите внимание, что ядра, помеченные PCM1 белым цветом, экспрессируют фактор транскрипции NKX2.5 красным цветом и окружены цитоплазмой кардиомиоцитов зеленого цвета.Эти данные в совокупности демонстрируют точность, с которой окрашивание на PCM one позволяет идентифицировать ядра кардиомиоцитов. На врезке показан эпинуклеарный характер окрашивания PCM one в ядрах миоцитов, на что также указывают стрелки в эксперименте, представленном на следующих трех рисунках; изолированные ядра сердечных клеток были окрашены красителем ДНК DRAC five и антителами к PCM one. Здесь, на совмещенном изображении двух предыдущих рисунков, стрелки снова указывают на эпинуклеарный характер окрашивания PCM one в изолированных ядрах кардиомиоцитов.Эта точечная диаграмма демонстрирует, что примерно 30% ядер, выделенных данным методом, являются ядрами кардиомиоцитов, что подтверждается их маркировкой PCM one. Наконец, как показывают эти гистограммы, ядра кардиомиоцитов мыши преимущественно диплоидны, на что указывает пик 2N, и только небольшая часть является тетраплоидной, что видно по более низкому пику 4N. Одним из преимуществ этого метода является возможность его легкой адаптации для других видов.Как и у людей.

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Медицина

Современные знания на клеточном основе сердечных заболеваний в основном опирается на исследования на моделях животных. Здесь мы опишем и проверить новый метод для получения одного жизнеспособного кардиомиоциты от небольших хирургических образцах миокарда человека желудочка. Миоциты человека желудочковая могут быть использованы для электрофизиологических исследований и тестирования на наркотики.

Выделение и функциональная характеристика человека желудочка кардиомиоцитов из свежих хирургических образцов

Количественная оценка оборота кардиомиоцитов является сложной задачей. Описанный здесь протокол вносит важный вклад в решение этой задачи, обеспечивая точную и чувствительную количественную оценку генерации ядер неокардиомиоцитов и плоидии ядер.

Одновременная оценка кардиомиоцитов синтеза ДНК и плоидности: метод для оказания помощи квантификации кардиомиоцитов регенерации и оборота

Чтобы отличить деление клеток от вариаций клеточного цикла в кардиомиоцитах, мы представляем протоколы с использованием двух трансгенных линий мышей: трансгенных мышей Myh6-H2B-mCh для однозначной идентификации ядер кардиомиоцитов и мышей CAG-eGFP-анилин для отличия деления клеток от вариаций клеточного цикла.

Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов

Целью этой работы является разработка метода воспроизводимой изоляции кардиомиоцитов от взрослого сердца и измерения содержания и нуклеации ДНК.

Изоляция кардиомиоцитов от фиксированных сердец для иммуноцитохимии и анализа плоидии

Представлен протокол для изоляции человека и животных желудочков кардиомиоцитов от вибрато-вырезать миокарда ломтиками. Высокие урожаи клеток, терпимых к кальцию (до 200 клеток/мг), можно получить из небольшого количества тканей (lt;50 мг). Протокол применим к миокарду, подвергаемому воздействию холодной ишемии на срок до 36 ч.

Изоляция желудочковых кардиомиоцитов человека от ломтиков миокарда вибромы

Мы разработалиупрощенный метод выделения высококачественных отдельных клеток сердца мыши с помощью метода антеградной перфузии. Этот метод не содержит Лангендорфа и полезен для выделения желудочковых и предсердных миоцитов или интерстициальных клеток, таких как сердечные фибробласты или прародители.

Метод перфузии Antegrade для выделения кардиомиоцитов у мышей

Золотым стандартом в кардиологии для клеточных и молекулярно-функциональных экспериментов являются кардиомиоциты. В этой статье описываются адаптации к методу Лангендорфа для выделения кардиомиоцитов мыши.

Простой и эффективный метод последовательной изоляции кардиомиоцитов мыши

Здесь мы описываем протокол для выделения достаточного количества единичных некардиомиоцитов с высокой жизнеспособностью из сердца мыши после инфаркта миокарда (ИМ). Это может быть использовано для последующего секвенирования отдельных клеток, анализа проточной цитометрии и первичной клеточной культуры.

Получение некардиомиоцитарной клеточной суспензии для секвенирования одноклеточной РНК из сердца взрослой мыши после инфаркта миокарда

Здесь мы представляем протокол, описывающий подготовку ядер клеток. После микродиссекции и ферментативной диссоциации сердечной ткани на отдельные клетки клетки-предшественники замораживали с последующим выделением чистых жизнеспособных клеток, которые использовали для секвенирования одноядерной РНК и одноядерного анализа на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным анализом секвенирования.

Выделение ядер из клеток-предшественников сердца мышей для профилирования эпигенома и экспрессии генов при одноклеточном разрешении

Образцы коронарной эндартеректомии ткани были обработаны для выделения отдельных ядер с использованием оптимизированного протокола диссоциации. Целостность изолированных ядер была подтверждена тремя комплементарными методами: окрашивание с исключением трипана для оценки целостности мембраны, конфокальная микроскопия на основе DAPI для подтверждения морфологии ядра и проточная цитометрия для количественной оценки выхода и чистоты ядер.

Выделение одиночных ядер из коронарной эндартеректомии пациентов с шунтированием коронарных артерий

Изучите метод выделения ядер кардиомиоцитов из посмертных тканей с помощью гомогенизации, центрифугирования и сортировки методом проточной цитометрии. Этот подход обеспечивает высокую чистоту образцов для дальнейших исследований.

Выделение ядер кардиомиоцитов с Посмертные тканей

Больше видео