Изображениями кальция Ответы на GFP с метками нейроны гипоталамуса фрагменты мозга мыши

Общая цель данной процедуры заключается в мониторинге индуцированных стимулом кальциевых ответов в срезах мозга с использованием незеленого флуоресцентного индикатора кальция, причем мониторинг осуществляется как пространственно, так и во времени в нейронах, меченных GFP. Это достигается путем первоначального извлечения мозга трансгенной мыши, экспрессирующей GFP в специфических клетках. На втором этапе с помощью микротома подготавливаются срезы ткани.

Затем на срезы наносят пипеткой раствор для загрузки индикаторного красителя кальция, чтобы обеспечить его поглощение клетками мозга. Заключительным этапом является запись временных меток флуоресцентных клеток с помощью конфокальной микроскопии. В конечном итоге ответы по кальцию в нейронах, меченных GFP, демонстрируются с использованием многоцветного анализа кальциевого имиджинга.

Основное преимущество данного метода по сравнению с существующими методами конфокальной микроскопии заключается в том, что мы можем визуализировать кальций в нейронах, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок GFP, используя смещенный в красную область спектра флуоресцентный индикатор кальция. Значительный стоксовый сдвиг красного флуорофора позволяет проводить многоцветной анализ красной флуоресценции в сочетании с зеленым GFP с использованием одной длины волны возбуждения. Идея этого метода возникла у нас, когда мы столкнулись с проблемой мониторинга кальциевых сигналов в нейронах, которые можно было идентифицировать только с помощью генетической флуоресцентной метки, которой являлся зеленый флуоресцентный белок.

Сейчас я продемонстрирую несколько критических этапов данной процедуры. Начните процедуру с разлива нагретого раствора агара в квадратную чашку Петри до высоты одного сантиметра; после охлаждения и затвердевания 4% агаровый гель нарезают на кубики размером один кубический сантиметр и помещают во флакон для хранения. После декапитации мыши сделайте разрез скальпа односторонним лезвием бритвы в центральном сагиттальном направлении от лобной кости до наружного затылочного бугра.

Затем далее раскройте разрез скальпа сначала в рострально-латеральном направлении, затем — в вентральном. После этого сделайте два латеральных и один ростральный разрез.

С помощью маленьких пружинных ножниц осторожно отсеките череп в области большого затылочного отверстия. К этому моменту затылочная, межтеменная и теменные кости должны быть отделены. Если твердая мозговая оболочка все еще присутствует, осторожно удалите ее пинцетом, чтобы избежать повреждения головного мозга.

Затем удалите чешуевидную кость, переднее решетчатое и лобное отверстия. Теперь мозг можно легко извлечь с помощью перевернутой микроложечки-шпателя, после чего следует перерезать черепные нервы. Мозг должен быть помещен вентральной стороной вниз на устойчивую к порезам поверхность.

Используйте одностороннее лезвие бритвы, чтобы удалить мозжечок. Эта ровная поверхность среза послужит основанием для закрепления мозга на пластине, что позволит выполнять нарезку корональных срезов мозга. Затем приклейте мозг срезом к базовой пластине микротома, используя небольшое количество быстроотверждающего высокоэффективного цианоакрилатного клея.

Затем с помощью блока агарового геля объемом 1 см³ приклейте вентральную сторону мозга к предметному стеклу микротома для поддержки и фиксации мозга во время нарезки. После высыхания соединительного слоя поместите стекло в кювету микротома с охлажденным до 6 °C оксигенированным экстрацеллюлярным раствором. Затем нарежьте мозг на срезы толщиной 300 мкм с низкой скоростью резки; собирайте корональные срезы мозга до тех пор, пока весь мозг не будет полностью секционирован.

Теперь приготовьте 20% раствор onic F1 27 в DMSO, добавив DMSO к порошку onic F1 27. Затем растворите его, подвергнув раствор воздействию ультразвука в течение двух минут. После этого добавьте пять µL 20% раствора onic F1 27 в пробирку, содержащую 50 µg проникающего в клетки furred am.

Перемешайте раствор с помощью пипетки. Затем добавьте в смесь 45 µL внеклеточного раствора и перемешайте на вортексе. После этого добавьте еще 325 µL внеклеточного раствора и подвергните пробирку ультразвуковой обработке в течение еще трех минут.

После ультразвуковой обработки добавьте 1,156 мл оксигенированного внеклеточного раствора для получения конечного раствора для загрузки кальциевого индикатора D. Перенесите корональные срезы мозга в шестилуночный планшет для культивирования клеток, заполненный оксигенированным внеклеточным раствором, из расчета до шести срезов на лунку. Затем аспирируйте оксигенированный внеклеточный раствор из камер, стараясь не повредить срезы мозга.

Затем дозированно внесите по 750 µL загрузочного раствора индикатора кальция D непосредственно в каждую лунку; срезы мозга должны быть полностью покрыты раствором, содержащим rore am. После этого инкубируйте срезы в CO₂-инкубаторе для культур клеток в течение 45–60 минут при 37 °C.

По окончании инкубации замените раствор для загрузки индикатора кальция DI свежим оксигенированным внеклеточным раствором, чтобы предотвратить избыточную нагрузку на клетки. Для мониторинга вызванных стимулом изменений флуоресцентного сигнала перенесите один из срезов мозга, нагруженных красным флуоресцентным красителем, в регистрирующую камеру и расположите его нужным образом. После установки камеры на конфокальный микроскоп перфузируйте срез оксигенированным внеклеточным раствором в течение 10 минут, чтобы удалить излишки внеклеточного индикатора кальция.

После выхода из регистрирующей камеры раствор PERFUSE eight собирают в вакуумный флакон. Затем осмотрите срез под микроскопом при малом увеличении. Отметьте ориентацию среза и найдите интересующую область; в нашем случае это гипоталамическая область мозга.

После этого переключитесь на большое увеличение. Найдите интересующую клетку в срезе, регистрируя изображения GFP и одновременно контролируя интенсивность флуоресценции красного сигнала URA. Отрегулируйте мощность лазера так, чтобы обеспечить возможность измерения изменений интенсивности красной флуоресценции URA и предотвратить выгорание обоих флуорофоров.

Затем начните получение изображений с частотой от 0,5 до 2 Гц для сбора сигналов fure и GFP. На этом рисунке показано конфокальное изображение нейронов GN, RHR Tau GFP в корональном срезе мозга. Здесь представлен относительно равномерный сигнал флуоресценции, наблюдаемый после загрузки среза мозга fure am, а здесь — совмещенное изображение нейронов, загруженных красителем-индикатором кальция.

Ниже приведены примеры кальциевых ответов на соматическую стимуляцию в отдельных нейронах с GFP-меткой в различных областях гипоталамуса. Различия в кальциевых сигналах между нейронами разных ядер гипоталамуса, экспрессирующими GN RHR, можно сравнивать, используя площадь под кривой в качестве оценки общего изменения уровня кальция в конкретной клетке за один и тот же период. После освоения данной методики ее выполнение занимает менее 90 минут, включая приготовление индикаторного красителя кальция, загрузку и инкубацию срезов, при условии правильного выполнения процедуры.