Сотовые конкретного анализа Arabidopsis Листья Использование флуоресценции клеток, активированных Сортировка

Общая цель этой процедуры заключается в выделении популяции протопластов, специфичных для клеточного типа, из листа. Это достигается путем выращивания растений, которые экспрессируют GFP в определенных типах клеток листа. Второй шаг заключается в сборе листьев и получении протопластов с помощью ферментативного пищеварения.

Затем протопласты фильтруются и сортируются с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток или фактов. Завершающим этапом является подтверждение точности сортировки с помощью флуоресцентной микроскопии. В конечном счете, отсортированные протопласты могут быть использованы для анализа экспрессии генов конкретного типа клеток, протеомного анализа или метаболического профилирования.

Флуоресцентная сортировка активированных клеток ранее успешно использовалась для корней, но она используется для выделения клеток листьев. Мечение GFP до этого метода было ограничено из-за интерференции флуоресценции хлорофилла. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение как быстрая, но тщательная подготовка образцов имеет решающее значение для минимизации обширных физиологических изменений, которые могут произойти во время сортировки клеток.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что они не будут знать, как настроить сортировщик клеток или как подтвердить точную сортировку. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области системной биологии растений. Проблема с идентификацией сетей регуляции генов в сложных многоклеточных органах, таких как лист, заключается в том, что разные типы клеток экспрессируют разные группы генов.

Эта генетическая информация теряется при анализе сбора урожая целого листа Демонстрация процедуры. Вместе со мной будут Эллисон Ас и Санджив Кума, которые обеспечивают техническую поддержку этой работы в нашей лаборатории. Сначала заполните девятисантиметровую круглую чашку Петри 20 миллилитрами раствора А, содержащего ферменты протопокрытия и ингибиторы транскрипции и РНК.

Затем соберите желаемый листовой материал для образцов, содержащих более одного листа, как показано здесь. Разложите листья в стопку до 15 листьев. Затем с помощью лезвия бритвы нарежьте листья на полоски шириной в один миллиметр.

Немедленно перенесите полоски листьев в чашку Петри с помощью плоского пинцета, аккуратно отделите полоски, а затем пропылесосьте образцы два раза в течение пяти минут каждый раз. Затем поместите чашку Петри на орбитальный шейкер с частотой вращения 90 оборотов в минуту при комнатной температуре и протопластите образцы на три-четыре часа. Во время инкубации с помощью пинцета отделяйте полоски листьев друг от друга с интервалом в полчаса.

После разложения аккуратно отфильтруйте раствор протопластов через сетчатое фильтр для клеток 70 микрон в 50-миллилитровую пробирку. Чтобы удалить полоски листьев, полоски будут сохранены. Протопласты будут просачиваться сквозь них.

Теперь с помощью четырех миллилитров раствора А аккуратно промойте лист полосками, собрав смывку в 50 миллилитровую пробирку. Затем переложите суспензию протопластов в пробирки с круглым дном и центрифугируйте протопласты в течение пяти минут при 300-кратном перегрузке и комнатной температуре. Стараясь не потревожить гранулу, осторожно отсадите как можно больше лежачего натанта, а затем промойте протопласты пятью миллилитрами раствора А в тех же условиях центрифуги.

Наконец, после удаления лежачего натанта используйте отрезной наконечник P 1000 для ресуспендирования PROTOPLAST в соответствующем объеме раствора A для сортировки непосредственно перед сортировкой. Используйте неразрезанный наконечник P 1000 для удаления любых комков в растворе Protoplasters. Далее диссоциируйте клетки, фильтруя протопласты в исходную трубку через филоновый фильтр 50 микрон.

Затем разбавьте раствор ячейки по мере необходимости, чтобы избежать засорения сопла источника ячейки. После определения оптимальных условий источника ячеек определите положительный GFP Proto plus с помощью 488-нанометрового Аргоннского лазера, сравнив выходной сигнал фильтра 580 с 30 полосами пропускания по сравнению с фильтром 530 с 40 полосами пропускания. Обратите внимание, что GFP-положительные протопласты появятся в популяции с высокими 530 и низкими 580

С протопластами без GFP в популяции с низким уровнем 530 и низким уровнем 580, мертвые умирающие протопласты и обломки появляются в популяции с высоким уровнем 580 для визуализации отсортированных протопластов с помощью флуоресцентной микроскопии, сортировать протопласты непосредственно по крайней мере в восемь объемов раствора A После сортировки концентрата, протопласты методом центрифугирования могут быть отсортированы в восемь объемов раствора A и собраны для визуализации на флуоресцентном микроскопе для проверки обогащения. На этом первом изображении показан пример обогащения клеточной линии TP 382, которая экспрессирует GFP в защитных клетках. Примеры выходов, полученных с помощью этого метода как до, так и после амплификации, сведены в эту таблицу.

Полученные количества от 500 пикограмм до 50 нанограммов достаточны для амплификации с помощью системы ovation PICO WTA и последующего анализа с помощью количественного ПЦР-секвенирования нового поколения или микрочипа. Следующая серия изображений показывает различные клеточные линии протопластов, выделенные и отсортированные только что описанным методом. Эти первые протопласты были получены из KC 2 74, оставляет поперечное сечение KC 2 74.

Лист показывает, что GFP экспрессируется в сосудистой сети. Эти протопласты были выделены из листьев KC 4 64, и поперечный срез листа KC 4 64 показывает, что экспрессия GFP обнаружена в эпидермисе A dal. Наконец, эти протопласты были получены из листьев ТР 3 82 в листьях ТР 3 82.

Здесь GFP выражается в защитных ячейках. Показаны типичные точечные диаграммы факсимильного захвата, иллюстрирующие выходной сигнал фильтра 5 80 30 нм в сравнении с фильтрами полосы пропускания 5 30 40 нм. Показанные сортировочные ворота обычно используются во время сортировки.

Этот первый стоп-участок из протопластов, полученных из четырех листьев угля, оштукатуренный в отсутствие ингибиторов, показывает одну популяцию 530 и 580 популяций. В то время как этот точечный график из четырехлистных протопластов, полученных из угля дикого типа, нанесенных в присутствии ингибиторов, демонстрирует сдвиг флуоресценции 580, который происходит из-за напряжения и окраски, вызванных ингибиторами. Эти точечные графики представляют собой листовые протопласты из линий KC 7 4, KC 4 64 и TP 3 82 соответственно.

Эти образцы также были загипсованы в присутствии ингибиторов, показывающих, что GFP содержится в популяциях с высоким содержанием 530 и низким уровнем 580. Для этого представителя сначала были получены количественные образцы для эксперимента ПЦР для каждого типа фракции. Затем образцы амплифицировали с помощью системы ovation PICO WTA и количественной ПЦР.

Проводили с использованием специфических праймеров GFP. Самые высокие значения показаны красным цветом, а самые низкие — зелеными, средние или единичные значения с использованием актина 2 в качестве референсного гена обозначены горизонтальными желтыми полосами. Получены результаты повторной верификации оптических оценок содержания ячеек GFP в отсортированных фракциях.

Население с высоким уровнем 530 и населением ниже 580 показало самые высокие измеримые уровни экспрессии GFP. В то время как популяции с высоким уровнем 530 и высоким уровнем 580 демонстрировали примерно в 1000 раз более низкую экспрессию GFP, популяции с низким уровнем 530, низким уровнем 580 и низким уровнем 530 высоким уровнем 580 демонстрировали низкие уровни экспрессии GFP, которые были сопоставимы с контрольными популяциями цельных листьев и несортированных протопластов. При выполнении этой процедуры важно помнить о постоянном контроле за сортировщиком ячеек и его повторной калибровке при необходимости для поддержания точности сортировки.

Найдена эта процедура. Другие методы, такие как микролучевой анализ, могут быть выполнены для сравнения и сопоставления уровней экспрессии генов в различных типах клеток. Теперь, когда эта методика разработана, мы анализируем экспрессию генов в определенных типах клеток листа на разных стадиях развития и сравниваем ее с данными всего листа, которые были созданы в агрономическом проекте.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать одноклеточные типы листьев с помощью сортировки флуоресцентно активированных клеток.