Сотовые конкретного анализа Arabidopsis Листья Использование флуоресценции клеток, активированных Сортировка

Общая цель данной процедуры — выделить популяцию специфичных для определенного типа клеток протопластов из листа. Для этого сначала выращивают растения, экспрессирующие GFP в конкретных типах клеток листа. На втором этапе собирают листья и получают протопласты с помощью ферментативного переваривания.

Затем протопласты фильтруют и сортируют с помощью метода флуоресцентной сортировки клеток или FACS. Заключительным этапом является подтверждение точности сортировки с помощью флуоресцентной микроскопии. В конечном итоге отсортированные протопласты могут быть использованы для анализа экспрессии генов, специфичной для определенного типа клеток, протеомного анализа или метаболического профилирования.

Сортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированного сепаратора ранее успешно применялась для корней, но в данном случае она используется для изоляции клеток листьев. Применение меток GFP до этого метода было ограничено из-за интерференции с флуоресценцией хлорофилла. Визуальная демонстрация этого метода имеет критическое значение, поскольку быстрая, но тщательная подготовка образцов необходима для минимизации значительных физиологических изменений, которые могут возникнуть в процессе сортировки клеток.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как им может быть неизвестно, как правильно настроить клеточный сортер или подтвердить точность сортировки. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области системной биологии растений. Проблема идентификации генных регуляторных сетей в сложных многоклеточных органах, таких как лист, заключается в том, что разные типы клеток экспрессируют разные группы генов.

Эта генетическая информация теряется при анализе сбора материала всего листа. Демонстрация процедуры. Со мной будут Эллисон А. и Санджив Кума, которые оказывают техническую поддержку этой работе в нашей лаборатории. Сначала наполните круглую чашку Петри диаметром 9 см 20 миллилитрами раствора A, содержащего ферменты для подготовки плашек, а также ингибиторы транскрипции и РНКаз.

Затем соберите необходимый листовой материал для образцов, состоящих более чем из одного листа, как показано на данном примере. Сложите листья в стопку высотой до 15 листов. Затем с помощью лезвия бритвы нарежьте листья полосками шириной 1 мм.

Немедленно перенесите полоски листьев в чашку Петри с помощью плоских пинцетов, аккуратно разделите их, а затем проведите вакуумную инфильтрацию образцов дважды по пять минут. Затем поместите чашку Петри на орбитальный шейкер, настроенный на 90 RPM при комнатной температуре, и проведите протопластирование образцов в течение трех-четырех часов. Во время инкубации каждые полчаса используйте пинцет, чтобы разделять полоски листьев друг от друга.

После переваривания осторожно профильтруйте раствор протопластов через клеточный фильтр с размером пор 70 микрон в пробирку объемом 50 миллилитров. Полоски листьев останутся на фильтре, а протопласты пройдут сквозь него.

Теперь используйте четыре миллилитра раствора A, чтобы аккуратно промыть полоски листьев, собирая промывочную жидкость в пробирку объемом 50 миллилитров. Затем перенесите суспензию протопластов в пробирки с круглым дном и центрифугируйте протопласты в течение пяти минут при 300 ×g и комнатной температуре. Осторожно, чтобы не повредить осадок, максимально полно аспирируйте супернатант, а затем промойте протопласты пятью миллилитрами раствора A при тех же условиях центрифугирования.

Наконец, после удаления верхнего слоя суспензии, используйте обрезанный наконечник P 1000, чтобы ресуспендировать ПРОТОПЛАСТЫ в соответствующем объеме раствора А непосредственно перед сортировкой. Используйте необрезанный наконечник P 1000 для раздробления любых комочков в растворе протопластов. Дополнительно диссоциируйте клетки, фильтруя протопласты в пробирку для сортировки через фильтр Fillon с размером пор 50 micron.

Затем разбавьте клеточный раствор соответствующим образом, чтобы избежать засорения сопла подачи клеток. После определения оптимальных условий подачи клеток идентифицируйте GFP-положительные протопласты с помощью 488-нанометрового лазера Argonne, сравнивая сигнал на выходе с 580/30 полосовым фильтром и 530/40 полосовым фильтром. Обратите внимание, что GFP-положительные протопласты будут находиться в популяции с высоким сигналом в канале 530 и низким в канале 580.

При наличии популяции протопластов без GFP с низкими значениями 530 и 580, погибшие и погибающие протопласты, а также клеточный дебрис появляются в популяции с высоким значением 580. Для визуализации отсортированных протопластов с помощью флуоресцентной микроскопии сортируйте протопласты непосредственно в минимум восемь объемов раствора А. После сортировки сконцентрируйте протопласты путем центрифугирования; протопласты могут быть отсортированы в восемь объемов раствора А и собраны для визуализации на флуоресцентном микроскопе с целью подтверждения обогащения. На этом первом изображении представлен пример обогащения клеточной линии TP 382, экспрессирующей GFP в замыкающих клетках. Примеры выхода, полученного с помощью данного метода как до, так и после амплификации, обобщены в этой таблице.

Количества в диапазоне от 500 пикограмм до 50 нанограмм достаточно для амплификации с помощью системы ovation PICO WTA и последующего анализа методом количественной ПЦР, секвенирования следующего поколения или микрочипирования. На следующей серии изображений представлены различные клеточные линии протопластов, выделенные и отсортированные описанным выше методом. Эти первые протопласты были получены из KC 2 74, листья — поперечный срез KC 2 74.

Лист показывает, что GFP экспрессируется в сосудистой системе. Эти протопласты были выделены из листьев KC 4 64, а поперечный срез листа KC 4 64 показывает, что экспрессия GFP обнаруживается в эпидермисе A dal. Наконец, эти протопласты были получены из листьев TP 3 82 в листьях TP 3 82.

Здесь GFP экспрессируется в замыкающих клетках. Представлены типичные точечные диаграммы сбора данных, иллюстрирующие выход с полосовых фильтров 580 ± 30 нм и 530 ± 40 нм. Показанные окна сортировки являются стандартными для данного процесса сортировки.

Эта первая диаграмма рассеяния протопластов, выделенных из листьев Arabidopsis thaliana линии Col-4 в отсутствие ингибиторов, показывает одну популяцию с низкими значениями 530 и 580. В то же время эта диаграмма рассеяния протопластов, выделенных из листьев Arabidopsis thaliana дикого типа линии Col-4 в присутствии ингибиторов, демонстрирует сдвиг флуоресценции 580, который возникает вследствие стресса и окрашивания, вызванных ингибиторами. Данные диаграммы рассеяния относятся к протопластам листьев линий KC 74, KC 464 и TP 382 соответственно.

Эти образцы также были проанализированы в присутствии ингибиторов, что показало локализацию GFP в популяциях с высоким уровнем 530 и низким уровнем 580. Для данного репрезентативного эксперимента по количественной ПЦР сначала были получены образцы для каждого типа фракций. Затем образцы были амплифицированы с использованием системы ovation PICO WTA и количественной ПЦР.

Было проведено амплифицирование с использованием специфических праймеров к GFP. Показанные значения представляют собой максимальные (отмечены красным) и минимальные (отмечены зеленым) средние или единичные значения; горизонтальными желтыми полосами указаны значения с использованием actin 2 в качестве референсного гена. Результаты подтверждают данные оптической оценки содержания GFP в отсортированных фракциях клеток.

Популяция с высоким уровнем 530 и низким уровнем 580 продемонстрировала самые высокие измеримые уровни экспрессии GFP. В то время как в популяции с высоким уровнем 530 и высоким уровнем 580 экспрессия GFP была примерно в 1000 раз ниже, популяции с низким уровнем 530 и низким уровнем 580, а также с низким уровнем 530 и высоким уровнем 580 показали низкие уровни экспрессии GFP, сопоставимые с показателями контрольных групп целого листа и несортованных протопластов. После освоения данной методики процесс от растения до получения отсортированной популяции клеток может занять от четырех до пяти часов при правильном выполнении. При проведении данной процедуры важно постоянно контролировать работу клеточного сортера и при необходимости проводить его повторную калибровку для поддержания точности сортировки.

Данная процедура была найдена. Для сравнения уровней экспрессии генов в различных типах клеток могут быть использованы и другие методы, такие как микрочиповый анализ. Теперь, когда эта методика разработана, мы анализируем экспрессию генов в специфических типах клеток листа на разных стадиях развития и сравним эти данные с результатами анализа всего листа, полученными в рамках проекта по агрономике.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять отдельные типы клеток листьев с помощью флуоресцентной сортировки клеток.