Механическая стимуляция хондроцитов-агарозы Гидрогели

Общая цель этой процедуры заключается в применении динамической механической сжимающей нагрузки к гидрогелям с затравкой клеток. Для этого первичные клетки получают путем рассечения и ферментативного расщепления срезов хряща. Изолированные клетки инкапсулируются в 2%-ный агрос, гидрогель, а с помощью биопсийного пунктора создаются клеточные семена.

Затем образцы помещаются в установку для сжатия и загружаются в микромеханический стимулятор со скоростью один Мах. Затем к засеянным клеткам конструкциям прикладывают динамическую сжимающую нагрузку для оценки синтеза коллагена и протгликанов. Конструкции имеют радиомаркировку после инкубации.

Изотопы количественно оцениваются сцинтилляционным подсчетом полученных данных, которые нормализуются до ДНК. Содержание показывает изменения в синтезе внеклеточного матрикса после механической стимуляции. Тем не менее, этот метод может дать представление о реакции встречного сайта и механической стимуляции.

Он также может быть применен к другим системам, таким как стволовые клетки, другие соединительные ткани или механорецептивные клетки. Пястные фатальные суставы скелетно зрелых коров, использованных здесь, были получены на местной скотобойне, работающей в зоне стерильного вскрытия. В колпак с ламинарным потоком поместите срезы хряща в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 20 миллилитров ветчины, F 12, содержащий 0,5% протеазы, и инкубируйте в течение двух часов при 37 градусах Цельсия.

После вакуума инкубации отсадите раствор протеазы и промойте ломтики, добавив ветчину. F 12 культуральную среду мягко закручивают, затем аспирируют. Повторите это, промойте еще два раза после третьей промывки, вакуумируйте отсасывание питательной среды.

Добавьте 20 миллилитров ветчины F 12, содержащей 0,15% коллагеназы А и высиживайте блюда в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день пипеткой проведите клеточную суспензию через сетчатый фильтр на 200 меш в чистую чашку Петри для промывки фильтра, пипеткой еще пять миллилитров ветчины F 12, собирая поток через нее в той же посуде. Переложите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 миллилитров

Вымойте чашку Петри с 10 миллилитрами ветчины F 12. Затем добавьте раствор для промывки в коническую трубку. Центрифугируйте пробирку при температуре от 600 до 800 RCF в течение шести-восьми минут при комнатной температуре.

Как только вращение завершится, аспирируйте надосадочную жидкость, стараясь не потревожить клеточную гранулу. Ресуспендируйте гранулу в 40 миллилитрах питательной среды. Центрифугируйте пробирку при температуре от 600 до 800 RCF в течение шести-восьми минут.

Повторите аспирацию, ресуспензию и центрифугирование еще дважды, в общей сложности три раза до третьего спина. Ресус. Приостановите небо путем взбалтывания и возьмите 500 микролитров аликвоты для подсчета клеток. Во время третьего спина используйте гемоцитометр и микроскоп с инвертированным светом, чтобы подсчитать жизнеспособные клетки в аликвоте по триановому синему исключению.

Затем, как только количество клеток будет определено, и третий спин будет завершен, аспирируйте снат и ресус. Суспендируйте гранулу в объеме питательной среды с удвоенной желаемой плотностью посадки. Здесь хондроциты ресуспендируются в соотношении 20 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр.

Следующим этапом процедуры является инкапсуляция выделенных первичных суставных хондроцитов в гидрогель aros в мензурке-суспензии 0,8 грамма aros. В 20 миллилитрах стерильного PBS. Поместите стакан на горячую плиту, установленную на 120 градусов по Цельсию, как только арос растворится.

Опустите огонь до 60 градусов Цельсия в конической трубке объемом 50 миллилитров. Соедините равные объемы клеточной суспензии с удвоенной желаемой концентрацией нагретого раствора аро. Здесь пять миллилитров клеточной суспензии добавляются к пяти миллилитрам 4%-ной суспензии Agros для получения окончательной 2%-ной гидрогелевой суспензии Agros тщательно смешивается с помощью пипетирования, избегая при этом образования крупных пузырьков, которые могут повлиять на жизнеспособность клеток.

Далее тщательно измельчите 10 миллилитров хондроцитарной смеси агроса в чашку Петри диаметром 60 миллиметров. Опять же, не допуская образования крупных пузырей. Накройте блюдо крышкой.

Затем дайте смеси настояться 30 минут при комнатной температуре. Как только смесь застынет, используйте четырехмиллиметровый биопсийный пунсон, чтобы получить как можно больше образцов гидрогеля хондроцитов агроса. Как правило, это составляет от 20 до 30.

Поместите образцы в чистую чашку Петри с помощью микрометра и запишите диаметр и высоту каждого образца. В идеале конструкция должна быть высотой около пяти миллиметров, отбросить все образцы, полученные из области, где высота образца превышает 2%Перенести образцы в свежую 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую 10 миллиметров полной среды. В этой части протокола конструкции с сидящими клетками будут механически стимулироваться динамической компрессией.

Это будет достигнуто с помощью специально разработанной компрессионной установки, которая механически соединяет PLA, загружающие конструкцию, с имитацией одной микромеханической системы, которая контролирует степень сжатия, применяемого к конструкциям. Самым сложным аспектом процедуры является загрузка образцов в компрессорную установку. Важно правильно отрегулировать пластины в буровой установке, чтобы обеспечить надлежащее применение динамической сжимающей нагрузки.

Перед использованием простерилизуйте металлические компоненты компрессорной установки в автоклаве. Стерилизуйте пластиковые компоненты с помощью этанола 70% в течение ночи и ультрафиолетового излучения в течение не менее 15 минут. Чтобы хондроциты не падали с помощью гидрогелевых конструкций, они не падают.

С помощью щипцов поместите 12 стерильных пластиковых стопорных колец в лунки 24-луночного планшета для культивирования. Внутренние диаметры стопорных колец должны быть больше конструктивных диаметров. Осторожно с помощью щипцов.

Переложите гидрогели хондро арос из чашки Петри на 24-луночную пластину, закрепив каждый из них в стопорном кольце. Переложите 400 микролитров готовой среды на каждый образец. Ну а далее соберите стерилизованную компрессионную установку и с помощью установочных винтов закрепите ПЛА.

Прикрепите компрессорную установку к 24-луночной культуральной пластине, чтобы обеспечить высвобождение гидрогелевого контакта и повторную фиксацию. Деформация конструкции установочных винтов будет приложена к этому ненагруженному опорному состоянию или состоянию нулевой деформации. Загрузите собранный компрессионный стенд в микромеханическую испытательную систему со скоростью один Мах с помощью установочного штифта.

Закрепите установку на вертикальной сцене, а затем с помощью установочного винта зафиксируйте ее на месте. Снимите зажим для расстояний. С помощью программного интерфейса Mach one установите частоту в один герц, амплитуду в 350 микрон и количество циклов в 1 200.

При этом динамическое сжимающее нагружение применяется к амплитуде деформации 10% в зависимости от исходной высоты образцов. Чтобы начать механическую стимуляцию, нажмите кнопку запуска, привод на одну мах. Загрузочное устройство, которое крепится к культуральной пластине, имеет шесть углублений, которые перемещаются вверх и вниз, стимулируя шесть образцов одновременно.

Нестимулированные контрольные образцы также находятся в той же культуральной тарелке, но не помещаются в лунки с углублениями. Когда прогон будет завершен, mach подаст звуковой сигнал, и привод перейдет в незагруженное исходное состояние. По окончании механической стимуляции замените приспособление для регулировки.

Ослабьте установочный винт установочного штифта и снимите компрессионный станок и культуральную пластину с испытательной системы рядом с радиометкой, гидрогелевая клетка конструирует пипетку как пяти микрокюри белковой метки трития пролена для синтеза коллагена хондроцитов, так и серы S 35 для синтеза протеогликана в каждую, хорошо инкубируйте радиометированные конструкции в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа для сбора радиометированных гидрогелевых конструкций. С помощью щипцов трижды промойте каждую гидрогелевую конструкцию погружением в PBS. Чтобы удалить любой невключенный изотоп, поместите промытую конструкцию в промытую пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Далее в пробирки объемом 1,5 миллилитра добавьте 500 микролитров раствора папе. Поместите их на нагревательный блок и дайте им перевариться при температуре 65 градусов Цельсия в течение 72 часов. После того, как дайджест будет завершен, образец должен выглядеть относительно чистым.

Сразу после разложения папе возьмите аликвоты по 100 микролитров из каждого образца, чтобы определить содержание ДНК с помощью анализа пико-зеленого D. Затем возьмите 100 микролитров аликвоты каждого образца, чтобы определить активность включенных изотопов с помощью подсчета бета-жидкости. Полученная изотопная активность затем должна быть нормализована до содержания ДНК для анализа.

Суставные хондроциты крупного рогатого скота aros образуют гидрогелевые конструкции, состоящие из 2% с 10 умножить на 10 до шестого. Клетки на миллилитр инкапсулированных клеток механически стимулировали с амплитудой 10% сжимающей деформации с частотой в один герц в течение от 20 до 60 минут, или от 1200 до 3600 циклов. Затем они были проанализированы на содержание ДНК и синтез внеклеточного матрикса путем включения радиоизотопов.

Как видно на рисунке, синтез ДНК и внеклеточного матрикса зависел от дозы. Содержание ДНК продемонстрировало значительное снижение на 35% в результате 20 или 30 минут стимуляции со значением p менее 0,01. 60 минут стимуляции не показали никакого эффекта. Специфический для хряща синтез коллагена и протеогликана определяли путем включения трития, пролина и серы S 35 соответственно.

Они продемонстрировали значительное увеличение примерно на 60% в ответ на 20 или 30 минут стимуляции со значением p менее 0,01. 60 минут стимуляции не показали заметного эффекта. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как механически стимулировать гидрогелевые культуры с помощью динамического оттиска и адаптировать этот протокол для использования в аналогичных приложениях.