Измерение антител воздействие на клеточные функции кардиомиоцитов изолированного

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении кардиотропных антител в плазме пациентов с дилатационной кардиомиопатией или другими заболеваниями сердца с аутоиммунной природой. Это достигается путем первоначального мини-иммуноабсорбции плазмы пациента на колоннах со сферическими анти-IgG для очистки иммуноглобулина G на втором этапе. В качестве клеточной основы для данного биоанализа используются вентрикулярные кардиомиоциты, выделенные из взрослых крыс линии Wistar.

Затем кардиомиоцитам дают время прикрепиться к покровным стеклам камеры и окрашивают их URA 2:00 AM для возможности наблюдения за внутриклеточными переходными процессами кальция во время сокращений, после чего тестируют IgG пациента, чтобы изучить его влияние на сократимость кардиомиоцитов. Результаты позволяют определить, содержит ли IgG пациента тропные антитела, основываясь на изменениях сократимости и переходных процессов кальция в изолированных кардиомиоцитах. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как стандартные иммуноанализы для обнаружения антител, является его независимость от конкретного антигена и возможность различать стимулирующие и блокирующие антитела.

Демонстрация данной процедуры была проведена при технической поддержке нашей лаборатории. Для начала процедуры подготовьте мини-иммуноабсорбционные колонки, заполнив пустую колонку Econopak тремя миллилитрами анти-IgG сфер на два миллилитра плазмы пациента, собранной в ЭДТА-пробирки. Затем поместите фильтр поверх анти-IgG сфер.

Отрежьте нижний кончик колонки и прижмите фильтр так, чтобы скорость потока составляла примерно одну каплю в секунду. Затем трижды промойте колонку объемом 0,9% Sodium chloride, равным объему плазмы. Внесите плазму в колонку; когда плазма полностью пропитает anti IgG Spheros, промойте её тем же объемом 0,9% sodium chloride. Затем внесите в колонку объем 0,2 молярного glycine hydrochloride при pH 2.8, равный объему плазмы, и дайте ему полностью пропитать сорбент.

Затем добавьте в колонку еще один объем гидрохлорида глицина. Соберите элюат в пробирку объемом 15 мл и доведите pH до 7,3 с помощью 0,5 М трис-гидрохлорида с pH 8,0 для регенерации колонки. Промойте её тремя плазменными объемами гидрохлорида глицина после заключительной промывки двумя объемами 0,9% раствора хлорида натрия.

Колонку можно использовать для следующего образца плазмы для применения на кардиомиоцитах. Собранную фракцию IgG необходимо диализовать против экспериментального буфера, сначала перенеся фракцию IgG в трубку с диализным мембранным фильтром из целлюлозного эфира с порогом отсечения по молекулярной массе 100 kilodaltons. Затем поместите трубку в один литр EB и медленно перемешивайте с помощью магнитной мешалки при четырех градусах Celsius. Через восемь часов перенесите диализную трубку в три литра свежего EB и диализуйте еще в течение 20 часов при четырех градусах Celsius после проведения диализа.

Кипятите образец в течение 30 минут при 57 °C на водяной бане. Для инактивации факторов комплемента определите общую концентрацию IgG и подготовьте аликвоты, содержащие по 330 µg IgG каждая. Для данной процедуры приготовьте изоляционный буфер без кальция в соответствии с сопроводительной статьей.

Затем залейте 80 мл IB в верхний резервуар перфузионной системы thermostat lanor, поддерживайте буфер при температуре 37 °C и аэрируйте его смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа в течение 30 минут. Растворите примерно 7 000–10 000 единиц коллагеназы второго типа и 174 мг БСА, не содержащего жирных кислот, в 20 мл IB, содержащего 112,5 мкМ хлорида кальция, и при необходимости отрегулируйте pH буфера для изоляции в верхнем резервуаре.

Затем анестезируйте крысу линии Wistar массой от 175 до 200 г, используя тиопентал в дозе 375 мкг/кг, добавив в раствор тиопентала 2 500 МЕ гепарина. После торакотомии осторожно извлеките сердце с сохранной дугой аорты и перенесите его в ледяной 0% раствор хлорида натрия. Удалите кровь и окружающие ткани из сердца.

Затем перенесите орган в свежий 0,9% раствор хлорида натрия и обнажите аорту. Включите редуктор потока системы Langendorff, чтобы добиться скорости закапывания от двух до трех капель в секунду. Затем подсоедините сердце к канюле.

Проводите перфузию в течение трех минут со скоростью потока одна капля в секунду, чтобы вымыть остатки крови. После этого циркулируйте IB в системе LOR. Затем удалите 20 мл буфера из верхнего резервуара.

Заполните резервуар раствором коллагеназы и долейте необходимое количество буфера, чтобы общий объем достиг 80 миллилитров. Затем циркулируйте раствор для переваривания еще в течение 27 минут. После этого отсоедините сердце от канюли.

Удалите предсердия и аорту, затем разрежьте желудочки на мелкие фрагменты. Дайте буферу для дигестии стечь в нижний резервуар. Уменьшите объем до максимум 40 мл для дальнейшего переваривания измельченных желудочков в течение 10–15 минут при постоянной аэрации смесью 95% oxygen, 5% carbon dioxide.

После этого профильтруйте клеточную суспензию через марлю с размером ячейки 200 micron в пробирку объемом 50 milliliter. В завершение восстановите содержание кальция в клетках, центрифугируя клеточную суспензию при 40 3G в течение двух минут. При комнатной температуре ресуспендируйте клетки в 10 milliliters.

Пробирки с 200 мкМ хлорида кальция снова центрифугируют, после чего клетки ресуспендируют в 10 мл буфера IB с 500 мкМ хлорида кальция. После финального центрифугирования кардиомиоциты ресуспендируют в стерильно отфильтрованном буфере EB до плотности 50 000 клеток на мл.

Покройте покровные стекла в четырехлуночной камере ламинином из расчета 10 micrograms на лунку и дождитесь полного высыхания. Затем внесите в каждую лунку по один миллилитр суспензии кардиомиоцитов. Используйте микропипетку с обрезанным наконечником и дайте клеткам прикрепиться в течение одного часа при комнатной температуре; разведите 10 microliters стокового раствора fira 2:00 AM в концентрации один миллиграмм на миллилитр в пяти миллилитрах eb и храните окрашивающий раствор в темном месте.

Затем удалите буфер и неприкрепившиеся клетки с покровных стекол. Пипеткой внесите 0,5 мл окрашивающего раствора. Инкубируйте клетки в каждой лунке в течение 10 минут при умеренном перемешивании. После этого удалите окрашивающий раствор и один раз промойте клетки 1 мл eb.

Затем добавьте по 0,5 миллилитра EB в каждую лунку согласно данной процедуре, поместите покровное стекло под инвертированный флуоресцентный микроскоп, подключенный к системе регистрации кальция и сократимости миоцитов. Поместите изготовленный на заказ электрод с трубками притока и оттока в первую лунку и перфузируйте кардиомиоциты раствором eb со скоростью 1 миллилитр в минуту.

Начните электрическую стимуляцию при напряжении 20 volts, частоте one hertz и длительности импульса five milliseconds, и дайте клеткам адаптироваться к стимуляции в течение примерно двух минут. Выберите целый палочковидный кардиомиоцит с четкой исчерченностью и постоянным сокращением и поместите его в центр поля зрения. Затем откройте канал камеры и ориентируйте клетку горизонтально в области видеозахвата, поворачивая адаптер для кадрирования клетки и перемещая предметный столик микроскопа.

Отрегулируйте границы детектирующих контрольных элементов видеообласти. Включите флуоресцентный канал и запишите от 10 до 15 сокращений, чтобы определить исходное укорочение клеток и кальциевые транзиенты. После этого выключите канал освещения микроскопа, чтобы избежать выгорания флуоресцентного красителя.

С помощью трехходового клапана перенаправьте поток из EB в байпас образца и перфузируйте кардиомиоциты 1 мл IgG пациента. Остановите насос непосредственно перед тем, как воздух достигнет лунки, включите световой канал и запишите еще 10–15 сокращений для получения острого клеточного ответа. Затем приостановите запись и снова выключите световой канал, повторите записи через две и пять минут, а по их завершении извлеките электрод из лунки. В конце проанализируйте укорочение клеток и кальциевые транзиенты с помощью программного обеспечения ion wizard, используя соответственно окно edge length/length и URA two numeric subtracted/ratio.

Затем рассчитайте процентные изменения для острого ответа, а также ответов через две и пять минут относительно исходного сокращения клетки и пиковой высоты кальциевого транзиента. Ниже представлен репрезентативный пример контрольного измерения. Сокращение клетки и кальциевый транзиент мониторировались в режиме реального времени до суперфузии IgG, а также сразу после неё — через две и пять минут.

А здесь представлен пример измерения образца IgG, содержащего кардиодепрессивные антитела. Укорочение клетки и кальциевый транзиент измерялись в режиме реального времени до суперфузии IgG, а также непосредственно через две и пять минут после суперфузии IgG. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выявлять кардиотоксические антитела в плазме пациента путем измерения влияния изолированного IgG на укорочение клетки и кальциевый транзиент изолированных кардиомиоцитов взрослых крыс.