Измерение антител воздействие на клеточные функции кардиомиоцитов изолированного

Общей целью данного эксперимента является выявление кардиотропных антител в плазме крови пациентов с дилатационной кардиомиопатией или другими заболеваниями сердца с аутоиммунным фоном. Это достигается за счет начальной мини-иммуноабсорбции плазмы пациента на колонках с антиIgG-сферосом для очистки иммуноглобулина G в качестве второго этапа. Желудочковые кардиомиоциты выделяются из взрослых крыс типа Wistar, обеспечивая клеточную базу для этого биоанализа.

Затем кардиомиоциты прикрепляют к крышке камеры и окрашивают URA 2:00 AM для того, чтобы можно было наблюдать за внутриклеточным переходным процессом кальция во время сокращений, затем тестируют IgG пациента для наблюдения за его влиянием на сократительную способность кардиомиоцитов. Результаты демонстрируют, содержит ли IgG пациента тропные антитела, основываясь на изменениях сократительной способности и переходного процесса кальция в выделенных кардиомиоцитах. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как стандартные иммунологические анализы для обнаружения антител, заключается в том, что он не зависит от конкретного антигена и позволяет различать стимулирующие и блокирующие антитела.

Демонстрация процедуры позволит Google и получить техническую помощь от нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте мини-колонки иммуноабсорбции, заполнив три миллилитра, анти-IgG-сферо на два миллилитра плазмы пациента с ЭДТА в пустую колонку экономака. Затем поместите фильтр поверх сферо, защищающих от IgG.

Разрежьте нижний кончик колонки и нажмите на фильтр, чтобы достичь скорости потока примерно одна капля в секунду. Затем трижды промыть колонку одним объемом плазмы 0,9%Пипеткой хлорида натрия пипеткой плазму в колонке, когда плазма полностью погрузится в промывку антиIgG Spheros тем же объемом 0,9% хлорида натрия. Затем пипетируйте один объем плазмы 0,2 моляра глицина гидрохлорида при pH 2,8 в колонке и дайте ему погрузиться в фос.

Затем добавьте в колонку еще один объем глицина гидрохлорида. Соберите поток в 15-миллилитровую пробирку и отрегулируйте pH до 7,3 с помощью 0,5 моляра трис гидрохлорида при pH 8,0 для регенерации колонки. Промойте его тремя плазменными объемами гидрохлорида глицина после окончательной промывки двумя объемами 0,9% хлорида натрия.

Колонка может быть использована для следующего образца плазмы для использования на кардиомиоцитах. Собранная фракция IgG должна быть диализирована против экспериментального буфера путем предварительного заполнения фракции IgG в мембранную пробирку для диализа на основе эфира целлюлозы с отсечкой по молекулярной массе при 100 килодальтонах. Затем поместите трубку в один литр EB и медленно перемешайте магнитной мешалкой при четырех градусах Цельсия Через восемь часов переложите диализную трубку в три литра свежего EB и диализируйте еще 20 часов при четырех градусах Цельсия после диализа.

Прокипятите образец в течение 30 минут при температуре 57 градусов Цельсия на водяной бане. Для инактивации факторов комплемента определяют общую концентрацию IgG и готовят аликвоты, каждая из которых содержит 330 мкг IgG. В этой процедуре приготовьте изоляционный буфер без кальция в соответствии с прилагаемой рукописью.

Затем залейте 80 миллилитров IB в верхний резервуар термостатной перфузионной системы и поддерживайте буфер на уровне 37 градусов Цельсия и аэрируйте его 95% кислорода, 5% углекислого газа в течение 30 минут. Растворите примерно от 7 000 до 10 000 единиц коллагеназы второго типа и 174 миллиграмма БСА без жирных кислот в 20 миллилитрах. IB содержит 112,5 микромолярного хлорида кальция и при необходимости отрегулировать pH изоляционного буфера в верхнем резервуаре.

Затем обезболите крысу Вистар в дозе от 175 до 200 граммов, используя тиопентал в дозе 375 микрограмм на килограмм с добавлением 2500 МЕ гепарина в раствор тиопентала. После торакотомии осторожно иссеките сердце с неповрежденной дугой аорты и переведите его в ледяной холод, нулевой процент хлорида натрия в ледяном холоде. Удалите кровь и окружающие ткани из сердца.

Затем переложите в него свежий 0,9% хлорида натрия и обнажите аорту. Включите редуктор потока системы лангора, чтобы получить скорость сброса два-три в секунду. Затем приложите сердце к канюле.

Перфузируйте его до трех минут со скоростью потока одна капля в секунду, чтобы смыть оставшуюся кровь. После этого циркулируйте IB в системе LOR. Теперь извлеките 20 миллилитров буфера из верхнего резервуара.

Заполните резервуар раствором коллагеназы и пополните буфер столько, сколько требуется, чтобы достичь 80 миллилитров. Затем циркулируйте раствор для варивания еще 27 минут. Далее отсоедините сердце от канюли.

Удалите предсердия и аорту, затем измельчите желудочки на мелкие кусочки. Дайте буферу для разложения стекать в нижний резервуар. Уменьшите объем максимум до 40 миллилитров для дальнейшего переваривания измельченных желудочков в течение 10-15 минут под непрерывной аэрацией с 95% кислорода, 5% углекислого газа.

После этого отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатую сетку размером 200 микрон в 50-миллилитровую трубку. Наконец, восстановите содержание кальция в клетках, центрифугируя клеточную суспензию при 40 3G в течение двух минут. При комнатной температуре ресуспендируйте ячейки в 10 миллилитров.

IB, содержащий 200 микромоляров хлорида кальция, снова центрифугируют и ресуспендируют клетки в 10 миллилитров. IB с 500 микромолярным хлоридом кальция. После заключительного центрифугирования, ресуспензии кардиомиоцитов в стерильных фильтрованных БЭ до плотности 50 000 клеток на миллилитр.

Покройте крышки стаканов в камере с четырьмя лунками 10 микрограммами ламинина на лунку и подождите, пока он полностью высохнет. Затем залейте по одному миллилитру суспензии кардиомиоцитов в каждую лунку. С помощью микропипетки с разрезанным кончиком и дайте клеткам прилипнуть в течение одного часа при комнатной температуре, разведите 10 микролитров из одного миллиграмм на миллилитр исходного раствора fira 2:00 AM в пяти миллилитрах, eb, и держите окрашивающий раствор в темноте.

Далее извлеките из буфера и из неприкрепленных ячеек из крышки стакана пипеткой 0,5 миллилитра красящего раствора. В каждой хорошо инкубируйте клетки в течение 10 минут при умеренном встряхивании. Впоследствии удалите окрашивающий раствор и промойте клетки один раз одним миллилитром эб.

Затем добавьте по 0,5 миллилитров EB в каждую лунку при этой процедуре, поместите покровное стекло под инверсный флуоресцентный микроскоп, подключенный к системе регистрации миоцитов кальция и сократительной способности. Поместите изготовленный на заказ электрод с приточной и всасывающей трубкой в первую лунку и супер. Сращивайте кардиомиоциты с одним миллилитром в минуту eb.

Начните электрическую стимуляцию при напряжении 20 вольт, частоте в один герц и пяти миллисекундах на импульс и дайте клеткам адаптироваться к стимуляции в течение примерно двух минут. Выберите интактный кардиомиоцит в форме палочки с четкой бороздчатостью и постоянным сокращением и расположите его в центре поля зрения. Затем откройте канал камеры и расположите ячейку горизонтально в области видео, вращая адаптер кадрирования клетки и перемещая предметный столик микроскопа.

Отрегулируйте границу детектирующих элементов управления видеообластью. Включите флуоресцентный канал и запишите от 10 до 15 сокращений, чтобы получить начальное укорочение клеток и переходный кальций. После этого выключите световой канал микроскопа, чтобы избежать обесцвечивания флуоресцентного пятна.

Переключите поток через EB на байпас образца с помощью трехходового клапана и супер Сгустите кардиомиоциты с одним миллилитром IgG пациента. Остановите насос непосредственно перед тем, как воздух достигнет его, включите световой канал и запишите еще 10-15 сокращений, чтобы получить острый клеточный ответ. Затем приостановите запись и снова выключите световой канал, повторите записи через две и пять минут и извлеките электрод из лунки, когда они закончатся, в конце концов, проанализируйте укорачивание ячейки и переходный процесс кальция с помощью программного обеспечения Ion Wizard, используя длину ребра, длину косой черты и окно коэффициента вычитания из двух чисел URA соответственно.

Затем рассчитайте процентные изменения для острой, двухминутной и пятиминутной реакции от начального укорочения клеток и высоты пика переходных процессов кальция. Вот репрезентативный пример контрольного измерения. Укорочение клеток и переходный цикл кальция контролировали в режиме онлайн до суперфузии с IgG и сразу через две минуты и пять минут после суперфузии с IgG.

А вот пример измерения образца IgG, содержащего кардиодепрессивные антитела. Укорочение клеток и транзиент кальция измеряли онлайн до суперфузии с IgG и сразу через две минуты и пять минут после суперфузии с IgG. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как обнаружить антитела к сердечно-сосудистому движению в плазме крови пациента путем измерения влияния выделенного IgG на укорочение клеток в кальциевом транзиторе выделенных взрослых красных кардиомиоцитов.