Быстрое выделение жизнеспособного циркулирующих опухолевых клеток из образцов крови пациентов

Циркулирующих клеток опухоли, выделенных из крови больных раком, не причиняя повреждения клеток. Изоляция опухолевых клеток достигается с помощью бимолекулярной поверхности Е-селектина в дополнение к антителам против эпителиальных маркеров. Нанотрубок покрытие специально способствует адгезии раковых клеток приводит к высокой чистоты захвата.

Общая цель этой процедуры заключается в выделении жизнеспособных, циркулирующих опухолевых клеток из образцов крови. Начните с подготовки изолирующих микропробирок, затем выделите охристую шерсть из образцов крови. Затем обработайте Buffy coat с помощью функционализированного устройства микропробирки.

Соберите захваченные клетки из микропробирки и поддерживайте культуру с помощью устройства, которое физиологически имитирует место для биомиметического захвата протекающих ЦОК без повреждения клеток. Этот метод обеспечивает функциональность в клинических условиях для разработки персонализированных методов лечения рака. Основные преимущества заключаются в том, что это простая техника, в которой используются общедоступные материалы, и она воссоздает естественный процесс твердой ткани, который происходит в кровеносных сосудах.

Я Майк Кинг, доцент кафедры биомедицинской инженерии в Корнельском университете, а демонстрировать процедуру будет Джефф Мэдисон, старший техник из моей лаборатории. Следующий протокол предназначен для производства устройства с одной микротрубкой, содержащего 250 микролитров 6,6% раствора нанотрубки Halo site. В течение 30 секунд вызывайте раствор холодной водой.

После повторного ультразвукового облучения наберите раствор в шприц. Отфильтруйте раствор через шприцевой фильтр 0,45 микрона в чистый вихрь для микромусора. Периодически используется нанотрубка halo site.

Для поддержания однородности приобретите участок микротрубки длиной 50 сантиметров. Разрежьте входное отверстие микротрубки по диагонали и вставьте один конец микротрубки в небольшой переходник IDEXX, а в другой конец микропробирки вставьте иглу для шприца. Чтобы очистить микропробирку, поместите открытый конец микропробирки в 70% этанол и наберите около 50 микролитров этанола в шприц, чтобы заполнить микропробирку и смыть этанол из микропробирки.

Наберите в шприц обильный объем дистиллированной воды. Теперь отсоедините шприц от микропробирки, опорожните шприц, а затем снова присоедините его к микропробирке. Наберите 50 микролитров по 0,02 веса на объем.

Полиоллизин в микропробирку и выдерживать в течение пяти минут комнатной температуры. Затем наберите в микропробирку 100 микролитров отфильтрованного раствора нанотрубки и инкубируйте в течение трех минут при комнатной температуре. Чтобы промыть раствор нанопробирки, наберите 100 микролитров воды через микропробирку и инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре, втяните 50 микролитров PBS через микропробирку, а затем 50 микролитров по 10 микрограмм на миллилитр.

Раствор белка G уравновесить в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем наберите в микропробирку 50 микролитров по пять микрограммов на миллилитр, раствор антител E селектина IgG и 50 микрограммов на миллилитр. Инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре, блокировать неспецифическую клеточную адгезию 5%-ным молочным белком.

Затем инкубируют PBS при комнатной температуре до тех пор, пока образцы крови или охристой шерсти не будут готовы к обработке за 10 минут до использования микропробирки для выделения клеток. Наберите 50 микролитров насыщенного кальцием PBS для активации молекул селектина в гепаринизированной пробирке. Соберите образец крови пациента объемом 10 миллилитров для выделения лимфоцитов.

Поместите 10 миллилитровый раствор fol pack в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Аккуратно наложите центрифугу для образцов цельной крови объемом 10 миллилитров при температуре 2000 умноженных на G на 15 минут, четыре градуса Цельсия с минимальным замедлением. Далее переложите слой баффового покрытия в новую трубку.

Вымойте охристую шерсть с помощью PBS и центрифугируйте для залегания эритроцитов. Аккуратно повторно суспендируйте клеточные гранулы в одном миллилитре лизиса эритроцитов, буферизируйте и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем добавьте 10 миллилитров.

PBS мягко перемешайте и прижмите клетки к нёбу путем центрирования. Аккуратно ресуспендируйте элементы в PBS plus с помощью адаптеров IDEXX. Прикрепите один конец функционализированной микротрубки к пятимиллилитровому шприцу.

Вставьте шприц в шприцевой насос и погрузите открытый конец функционализированной микротрубки в клетку для предотвращения выбросов. Проработайте клеточную суспензию через микротрубку, чтобы удалить несвязанные и слабо связанные клетки. Переложите открытый конец микропробирки в пробирку, содержащую PBS plus.

Наберите в шприц 300 микролитров PBS plus. Затем поместите открытый конец микропробирки в чистую пробирку. Отсоедините шприц от микропробирки и прикрепите шприц, содержащий острое перфузное перфузирование, чтобы заполнить микропробирку.

После 10-минутной инкубации при комнатной температуре прикрепите шприц, содержащий один миллилитр питательной среды, проведите микропробирку и соберите отработанные вещества в соответствующие ткани. Тарелки для культивирования приступают к культуре. Выделенные циркулирующие опухолевые клетки были выделены из образцов крови пациента с раком молочной железы и пациента с раком легких через пять дней.

В культуре. Эти препараты характеризовали для захвата ЦОК на основе окрашивания на эпителиальную клеточную молекулу эпикан, а также чистоту захвата ядра рассчитывали как процент клеток, которые были идентифицированы как КТ С, по сравнению с общим количеством захваченных клеток. На этом изображении представлены репрезентативные микрофотографии ЦОК, выделенных от доноров А и В. После пяти дней культивирования клетки были флуоресцентно окрашены на EPAM с помощью Alexa Fluor 4 88.

Ядра визуализировали с помощью окрашивания DPI. После этой процедуры жизнеспособные ЦОК и культура могут быть использованы для получения специфической для пациента информации, такой как чувствительность к препарату или экспрессия клеточных маркеров. Спасибо за просмотр и удачи.