Напряжение чувствительные краски Запись с аксонов, дендритов и дендритных шипиков отдельных нейронов в срезах мозга

Общая цель описанных экспериментов заключается в оптическом мониторинге интеграции сигналов мембранного потенциала и обработки информации отдельной нервной клеткой с субмикронным и субмиллисекундным разрешением в нескольких точках одного нейрона. Для этого сначала создается установка для визуализации с соответствующей чувствительностью, позволяющей регистрировать небольшие относительные изменения интенсивности света, соответствующие переходным процессам мембранного потенциала. Затем отбираются нейроны с подходящей анатомией для эффективной визуализации — нейроны с длинными неповрежденными отростками, расположенные в одной фокальной плоскости близко к поверхности среза.

Затем в предварительно выбранные нейроны вводят вольтаж-чувствительные красители для возможности оптического отслеживания изменений мембранного потенциала. Результаты демонстрируют уникальную способность данного подхода получать информацию об интеграции электрических сигналов отдельными нервными клетками путем мониторинга сигналов мембранного потенциала аксонов, дендритов и дендритных шипиков в клеточной нейрофизиологии.

В настоящее время разрабатываются новые инструменты, поскольку традиционная электрофизиология имеет два давних ограничения: низкое пространственное разрешение электродных измерений и невозможность регистрации сигналов из таких малых структур, как коллатерали аксонов или дендритные шипики. Чтобы преодолеть эти недостатки, метод патч-клампа можно сочетать с оптическими методами, которые позволяют проводить параллельную запись из всех частей нейрона. Здесь мы описываем такой метод — многоточечную оптическую регистрацию переходных процессов мембранного потенциала с разрешением до одного шипика.

В данном эксперименте для настройки равномерности освещения используются вертикальный микроскоп и три камеры. Сначала установите подходящий нейтральный светофильтр на пути лазерного луча. Затем сфокусируйте объектив на поверхности стандартного флуоресцентного предметного стекла.

Наблюдая за ПЗС-изображением поля зрения на экране монитора, отрегулируйте положение приемного конца кварцевого световода и положение выходного конца световода с помощью соответствующих приводов на эпифлуоресцентном конденсаторе, чтобы добиться центрированного и равномерного освещения поля зрения. Для определения вибрационного шума используйте стандартный флуоресцентный предметный препарат с не флуоресцирующей меткой на поверхности. Запишите интенсивность света с помощью нейронной ПЗС-камеры в режиме непрерывной записи.

Наведите объектив на темный край черной метки и зарегистрируйте интенсивность света в течение примерно 100 миллисекунд при частоте кадров 2 кГц. Затем отобразите пространственное среднее траекторий относительной интенсивности света от примерно 20 пикселей, принимающих свет из равномерно освещенной области, и от примерно 20 пикселей вдоль края черной метки. Избыточный шум в пространственном среднем по пикселям с высококонтрастными краями отражает вибрационный шум в системе.

Необходимо установить механический затвор вне виброизоляционного стола, чтобы открытие затвора не создавало вибрационного шума при оптической записи. Это критически важный этап. Закрепите затвор с помощью пластиковых винтов и виброизоляционного материала, чтобы снизить акустический вибрационный шум, который может быть зафиксирован системой оптической записи.

Для изоляции вибраций отрегулируйте виброизоляционный стол до тех пор, пока вибрационный шум пикселей, приходящихся на резкий край изображения, не станет меньше дробового шума. Провода оборудования на столе должны лежать свободно, чтобы избежать передачи механических вибраций на окуляры микроскопа. В данной процедуре подготовьте срезы мозга толщиной от 300 до 400 мкм в соответствии со стандартными протоколами, используя линию мышей, экспрессирующих EGFP в интересующих отдельных нервных клетках, с использованием конфокальной системы со спиннинговым диском.

Визуализируйте нейроны, меченные EGFP, в срезе. Затем выберите нейроны с сохранными дендритно-аксональными деревьями и отростками, расположенными параллельно и близко к поверхности среза, для проведения визуализации мембранного потенциала. После этого заполните стеклянную патч-пипетку от кончика безкрасителем внутриклеточным раствором до двух третей конуса электрода, создав отрицательное давление примерно на 15 секунд.

После этого заполните электрод раствором, содержащим мембранный IMP проницаемый вольт-чувствительный краситель, растворенный во внутриклеточном растворе. Затем, в течение одной минуты после заполнения электрода красителем, проведите патч-кламп ранее выбранного нейрона. Перед погружением пипетки в ванну подайте низкое положительное давление около 10 мм рт ст; поддержание такого давления при позиционировании электрода в срезе гарантирует, что краситель не вытечет из электрода до установления плотного контакта (seal).

Непосредственно перед касанием электрода поверхности клетки увеличьте давление до высокого уровня, примерно 100 мм рт. ст. После установления герметичного контакта в конфигурации «whole cell» (целая клетка) обеспечьте свободную диффузию красителя из соматической патч-пипетки в сому в течение 20–45 минут. Во время диффузии красителя контролируйте физиологическое состояние нейрона, регистрируя вызванные потенциалы действия в режиме фиксации тока (current clamp).

Кроме того, контролируйте степень окрашивания, регистрируя интенсивность покоящегося света от сомы клетки с частотой кадров 2 кГц и при частичной интенсивности освещения, отрегулированной с помощью нейтральных светофильтров. Продолжайте процесс загрузки до тех пор, пока потенциал действия не начнет расширяться. По завершении окрашивания осторожно извлеките патч-пипетку из сомы в режиме фиксации напряжения (voltage clamp), чтобы обеспечить переход от конфигурации «whole cell» к конфигурации «outside-out patch».

Затем инкубируйте срез еще от 1,5 до двух часов при комнатной температуре, чтобы дать вольточувствительному красителю проникнуть в нейронные отростки. После того как значительное количество красителя диффундирует из сомы в дендритные и аксональные отростки, форма волны потенциала действия должна полностью восстановиться. На следующем этапе найдите сому окрашенного нейрона при слабой интенсивности флуоресценции.

Снизьте интенсивность света с помощью нейтральных светофильтров до минимального уровня, необходимого для визуализации исследуемого объекта с использованием предметного столика XY. Сканируйте область среза, содержащую флуоресцентный нейрон, до тех пор, пока не будет обнаружено флуоресцентное тело нейрона. Расположите тело окрашенной клетки в центре поля зрения микроскопа. Выполните патч-clamp нейрона с помощью стандартного патч-электрода без красителя в режиме дифференциального интерференционного контраста (DIC). Затем визуализируйте нейронные отростки при низкой интенсивности флуоресценции с частотой кадров от 10 до 40 Гц в режиме непрерывной записи ПЗС-камеры для вольтажной визуализации.

С помощью перемещения предметного столика по осям XY центрируйте интересующий нейрональный отросток в области визуализации. Кроме того, защитите тело нейрона (SOMA) от возбуждающего света, используя частично закрытую диафрагму микроскопа, чтобы уменьшить фотодинамическое повреждение. Затем зарегистрируйте оптические сигналы, связанные с ретроградными потенциалами действия в отдельных дендритных ветвях.

Затем зарегистрируйте оптические сигналы, соответствующие потенциалам действия в аксоне. После этого зарегистрируйте оптические сигналы, соответствующие ретроградно распространяющимся потенциалам действия в дендритных шипиках. Используйте соответствующую частоту кадров для точной реконструкции формы сигнала.

Одновременно с этим следует максимально сократить периоды записи и время воздействия высокоинтенсивного возбуждающего света, чтобы минимизировать выцветание красителя и фотодинамические повреждения. Здесь показан процесс регистрации оптических сигналов. На верхней панели представлено конфокальное изображение окрашенного нейрона с аксоном в положении для записи в высоком разрешении.

В то время как на средней панели представлено изображение флуоресценции аксона с низким пространственным разрешением, полученное с помощью ПЗС-камеры, используемой для визуализации мембранного потенциала, на нижней панели показаны записи с электродов из сомы, а также оптические записи из начального сегмента аксона (A IS) и узла Ранвье. Представлены необработанные данные и обработанные сигналы. На данном рисунке показаны сигналы потенциала действия аксона коркового нейрона слоя L5, заполненного вольт-чувствительным красителем.

Потенциальные соответствующие сигналы регистрировали с частотой кадров 10 килогерц. Эти кривые отображают переходный процесс потенциала действия в трех точках. Первая — электрод, регистрирующий сигнал из сомы.

Во-вторых, оптические записи из аксонного холмика, и в-третьих, оптическая запись из первого узла Ранвье, а здесь представлены наложенные друг на друга сигналы из этих же трех локаций. На данном рисунке показан всплеск из четырех сигналов обратно распространяющихся потенциалов действия из нескольких точек дендритного дерева кортикального нейрона L5, вызванный короткими деполяризующими импульсами тока с частотой 100 hertz. Здесь представлены сигналы потенциала действия из отдельного дендритного шипика.

Здесь представлена анатомическая реконструкция, полученная на основе стека изображений, сделанных с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском, а здесь — флуоресцентное изображение той же области, полученное с помощью ПЗС-камеры. Для визуализации мембранного потенциала на правой панели показаны кривые интенсивности флуоресценции, соответствующие ретроградным потенциалам действия в точках с первой по третью, отмеченных на ПЗС-изображении. Нижняя кривая соответствует записи электрода из сомы.

Подготовка к записи занимает около трех часов, включая время, необходимое для распространения красителя к дистальным отросткам. Время записи ограничено естественным ухудшением состояния препарата и фотодинамическим повреждением, вызываемым PO. Степень фотодинамического повреждения пропорциональна интенсивности возбуждающего света, а также продолжительности и количеству отдельных серий записей.

В некоторых экспериментах за один или два часа можно провести более 50 регистрационных проб. Другие измерения требуют более высокого возбуждения, большей интенсивности света и более длительной регистрации, что из-за фотодинамического повреждения ограничивает количество проб всего несколькими. После просмотра этого видео вы получите детальное представление о том, как проводить визуализацию напряжения во всей аксональной и дендритной структуре отдельных нейронов в срезах мозга.