Напряжение чувствительные краски Запись с аксонов, дендритов и дендритных шипиков отдельных нейронов в срезах мозга

Общей целью описанных экспериментов является мониторинг интеграции сигнала мембранного потенциала и обработки информации отдельной нервной клеткой оптически с субмикрометровым и субмиллисекундным разрешением от нескольких участков нейрона. Это достигается путем создания системы визуализации с соответствующей чувствительностью, позволяющей регистрировать небольшие дробные изменения интенсивности света, соответствующие переходному процессу мембранного потенциала. Затем выберите нейроны с подходящей анатомией для эффективной визуализации нейронов с длинными интактными отростками в одной фокальной плоскости близко к поверхности среза.

Затем загрузите предварительно выбранные нейроны чувствительными к напряжению красителями, чтобы обеспечить оптическое отслеживание изменений потенциала мембраны. Результаты показывают уникальную возможность этого подхода получать информацию об интеграции электрических сигналов отдельными нервными клетками путем мониторинга мембранных потенциальных сигналов от аксонов, дендритов и дендритных шипиков. В клеточной нейрофизиологии.

Новые инструменты разрабатываются из-за двух давних ограничений традиционной электрофизиологии: низкого пространственного разрешения измерений электродов и невозможности записи с небольших структур, таких как аксонные коллатерали или дендритные шипы. Чтобы преодолеть эти недостатки, подход с использованием патч-электродов можно сочетать с оптическими методами, которые позволяют проводить параллельные записи со всех частей нейросистемы. Здесь мы опишем такую методику, многостороннюю оптическую регистрацию мембранных потенциальных переходных процессов с разрешением одного шипа.

В этом эксперименте вертикальный микроскоп и три камеры используются для регулировки равномерного освещения. Во-первых, вставьте соответствующий фильтр нейтральной плотности в траекторию лазерного луча. Далее сфокусируйте объектив на поверхности стандартного флуоресцентного предметного стекла.

Во время наблюдения за ПЗС-изображением поля зрения на экране монитора отрегулируйте положение приемного конца кварцевого световода и положение выходного конца световода с помощью соответствующих актуаторов на эпифлуоресцентном конденсаторе с целью достижения центрированного и равномерного освещения поля зрения. Чтобы определить вибрационный шум, используйте стандартное флуоресцентное стекло с нефлуоресцентной меткой на поверхности. Записывайте интенсивность света с помощью нейроПЗС-матрицы в непрерывном режиме.

Сфокусируйте объектив на темном краю черной метки, запишите интенсивность света в течение примерно 100 миллисекунд с частотой кадров два килогерца. Затем отобразите среднее пространственное значение кривых интенсивности дробного света от примерно 20 пикселей, получающих свет от равномерно освещенной области, и от примерно 20 пикселей вдоль края черной метки. Избыточный шум в среднем пространственном уровне от пикселей с высококонтрастными краями отражает вибрационный шум в системе.

Важно, чтобы механический затвор был установлен на виброизоляционном столе, чтобы при открытии затвора не возникал вибрационный шум при оптической записи. Это критически важный шаг. Установите затвор с помощью пластиковых винтов и виброизоляционного материала, чтобы уменьшить акустический вибрационный шум, который может улавливаться оптической системой записи.

Чтобы изолировать вибрацию, отрегулируйте таблицу виброизоляции до тех пор, пока шум вибрации пикселей, покрывающих резкий край изображения, не станет меньше шума выстрела. Провода оборудования на столе должны быть ослаблены, чтобы избежать передачи механических колебаний на микроскоп. В этой процедуре срезы мозга толщиной от 300 до 400 микрон в соответствии со стандартными процедурами с помощью мышиной линии, экспрессирующей EGFP в отдельных нервных клетках, представляющих интерес, с помощью конфокальной системы вращающегося диска.

Визуализируйте помеченные EGFP нейроны в срезе. Затем выберите нейроны с интактными дендритными аксональными деревьями, а также с отростками, протекающими параллельно и близко к поверхности среза, для визуализации мембранного потенциала. Затем заполните стеклянную патч-пипетку с наконечника внутриклеточным раствором без красителей до двух третей конусности электрода, прикладывая отрицательное давление в течение примерно 15 секунд.

После этого засыпьте электрод раствором, содержащим раствор мембранного пермеата IMP и чувствительного к напряжению красителя, растворенного во внутриклеточном растворе. Теперь заплатите ранее выбранный нейрон в течение одной минуты после загрузки красителя в электрод. Приложите низкое положительное давление около 10 миллиметров ртутного столба перед тем, как пипетка будет опущена в ванну, и при размещении электрода в срезе это гарантирует, что краситель не вытечет из электрода до того, как уплотнение будет установлено.

Увеличьте до высокого давления около 100 миллиметров ртутного столба непосредственно перед тем, как электрод соприкоснется с поверхностью элемента. Устанавливая уплотнение во всей конфигурации клетки, обеспечьте свободную диффузию красителя из пипетки соматического пластыря в сому в течение от 20 до 45 минут. Во время окрашенной диффузии контролируйте физиологическое состояние нейрона, записывая вызванные потенциалы действия в режиме текущего зажима.

Кроме того, контролируйте степень окрашивания, записывая интенсивность света покоя от сомы клетки с частотой кадров два килогерца и с долей полной интенсивности света, отрегулированной с помощью фильтров нейтральной плотности. Продолжайте процесс загрузки до тех пор, пока потенциал действий не начнет расширяться. В конце окрашивания осторожно потяните патч-пипетку в сторону от конфигурации клеммы сомы в напряжении, чтобы обеспечить переход от целой ячейки к конфигурации внешнего выхода.

Затем S инкубируют срез еще от 1,5 до двух часов при комнатной температуре, чтобы позволить чувствительному к напряжению красителю распространиться в нейронных процессах. После того, как значительное количество красителя диффундирует из сомы в дендритные и аксональные отростки, волновая форма потенциала действия должна быть полностью восстановлена. На следующем этапе найдите сому окрашивающего нейрона под флуоресценцией низкой интенсивности.

Уменьшите интенсивность света с помощью фильтров нейтральной плотности до минимума, необходимого для визуализации интересующего объекта, с помощью XY-ступени Сканируйте область среза, содержащую флуоресцентный нейрон, до тех пор, пока флуоресцентная сома не будет идентифицирована. Расположите сому окрашенной клетки в центре поля микроскопа, прижмите нейрон стандартным патч-электродом без красителя под ДВС. Затем визуализируйте нейронные процессы в условиях флуоресценции низкой интенсивности с частотой кадров от 10 до 40 Гц в режиме непрерывной записи ПЗС-матрицы для визуализации напряжения.

Используя положение XY-стадии, нейронный отросток представляет интерес в середине области визуализации. Кроме того, защитите СОМА от возбуждающего света с помощью частично замкнутой диафрагмы поля ограничителя диафрагмы микроскопа для уменьшения фотодинамического повреждения. Затем запишите оптические сигналы, связанные с потенциалами обратного распространения в отдельных дендритных ветвях.

Затем запишите оптические сигналы, связанные с потенциалами действия в аксоне. После этого запишите оптические сигналы, связанные с потенциалами обратного распространения в дендритных шипах. Используйте соответствующую частоту кадров для точного восстановления формы сигнальной волны.

В то же время делайте периоды записи и воздействие возбуждающего света высокой интенсивности как можно короче, чтобы свести к минимуму обесцвечивание красителя и фотодинамические повреждения. Запись оптических сигналов показана здесь. Здесь. На верхней панели отображается конфокальное изображение окрашенного нейрона с высоким разрешением, аксон которого находится в положении записи.

В то время как на средней панели отображается флуоресцентное изображение аксона с низким пространственным разрешением, полученное с помощью ПЗС-матрицы, используемой для визуализации мембранного потенциала, на нижней панели представлены записи электродов от сомы и оптические записи от A IS и узла rvi. Отображаются исходные данные и обработанные сигналы. На этом рисунке показаны сигналы потенциала действия от аксона L-пяти корковых нейронов, нагруженных чувствительным к напряжению действием красителя.

Потенциально связанные сигналы регистрировались с частотой кадров 10 килогерц. Эти трассы указывают на потенциальное действие переходного процесса из трех мест. Во-первых, запись электродов с сомы.

Во-вторых, оптические записи с холма аксона, и в-третьих, оптическая запись с первой ноты vie, а вот наложенные сигналы из тех же трех мест. На этом рисунке показан всплеск из четырех сигналов обратного распространения потенциала действия из нескольких мест на дендритном стволе нейронов коры головного мозга типа L пять, инициируемый короткими импульсами деполяризующего тока с частотой 100 Гц. Здесь показаны сигналы потенциала действия от отдельного дендритного шипа.

Вот анатомическая реконструкция, полученная из стопки конфокальных изображений вращающегося диска, а вот флуоресцентное изображение той же области, полученное с помощью ПЗС-камеры. Для визуализации мембранных потенциалов на правой панели отображаются кривые интенсивности флуоресценции, соответствующие потенциалам обратного действия от первого до третьего, как показано на ПЗС-изображении. Нижняя кривая указывает на запись электрода с сомы.

Предварительная подготовка к записи занимает около трех часов, включая период ожидания, пока игральные кости перекинутся на дистальные отростки. Время регистрации ограничено нормальным выбеганием препарата и фотодинамическим повреждением ПО. Величина фотодинамического повреждения пропорциональна интенсивности возбуждающего света, а также продолжительности и количеству отдельных попыток регистрации.

В некоторых экспериментах можно провести более 50 попыток записи в течение одного-двух часов. Другие измерения требуют высокого возбуждения, интенсивности света и более длительных записей, а фотодинамические повреждения ограничиваются лишь несколькими попытками записи. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить визуализацию напряжения со всей аксональной и конечной структуры отдельных нейронов в срезах мозга.