Изучение артериальной гладких мышц KV7 калиевых каналов функцию с помощью Patch Clamp электрофизиологии и давления Миография

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы измерить активность семи калиевых каналов KV в свежедиссоциированных гладкомышечных клетках брыжеечной артерии и связать ее с измерениями диаметра артерий, зарегистрированными в физиологических условиях. Это достигается путем хирургического удаления брыжеечного сосуда у крысы. Вторым шагом является рассечение и очистка сегментов брыжеечных артерий.

Далее некоторые сегменты используются для выделения отдельных гладкомышечных клеток для электрофизиологических измерений KV семи калиевых токов. Заключительным этапом является канюляция интактных артериальных сегментов для измерения артериального давления и констрикции или дилатации в ответ на фармакологические модуляторы семи калиевых каналов KV. В конечном счете, комбинация электрофизиологии пластыря и миографии давления используется для того, чтобы показать, как увеличение или уменьшение активности семи калиевых каналов KV влияет на сужение брыжеечных артерий.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как использование клонированных каналов, экспрессируемых в клеточных линиях, заключается в том, что токи регистрируются от некультивируемых клеток, которые изначально экспрессируют каналы, а токи KV могут быть выделены из других классов калиевых каналов, которые могут быть активированы в тех же клетках. Прессивная миография позволяет регистрировать функциональные реакции из той же ткани, из которой получены выделенные клетки, и этот метод является более чувствительным и более физиологичным, чем другие препараты, такие как артериальные кольца или артериальные полоски. Доктор Барет Мани, научный сотрудник моей лаборатории, продемонстрирует методы канюляции артерий и миографии под давлением, а доктор Люба Брюггеман, научный сотрудник моей лаборатории, продемонстрирует процедуры изоляции клеток и планирования патчей.

Чтобы начать эту процедуру, с помощью хирургических ножниц отрежьте сегмент длиной от 10 до 12 сантиметров на обоих концах тонкой кишки крысы. Затем изолируют кишечник вместе с прикрепленной к нему сосудистой сетью. Далее прижмите сегмент тонкой кишки.

Распространите брыжейку на ближнюю сторону камеры таким образом, чтобы первичная ветвь верхней брыжеечной артерии находилась в центре, а последующий порядок ветвей расходился от центра. Затем располагают штифты только на сегментах кишечника, визуализируя их через подсвеченный рассекающий микроскоп. Осторожно очистите жировую ткань и соединительную ткань, окружающую артерии второго-четвертого порядка, расположенные рядом с кишечником, с помощью микрощипцов и ножниц.

Удерживайте соседние вены, чтобы облегчить очищение жировой ткани и соединительной ткани и избежать ненужного растяжения артерий. Теперь перенесите два-три сегмента брыжеечной артерии в 35-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую два миллилитра ледяного изоляционного раствора. После этого поставьте чашку на лед, разрежьте сегменты брыжеечной артерии на кусочки длиной три-четыре миллиметра с помощью пипетки PEs с отполированным кончиком.

Перенесите артериальные сегменты в стеклянный флакон, содержащий два миллилитра предварительно подогретого раствора для изоляции при температуре 37 градусов Цельсия. Затем выдерживайте его в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Через 30 минут осторожно отасуньте изолирующий раствор при температуре 37 градусов Цельсия с помощью задней пипетки.

Добавьте в него два миллилитра теплого ферментного раствора, после чего выдержите 35 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Сразу после 35-минутной инкубации в растворе фермента поместите флакон на лед, отасуньте раствор фермента и добавьте два миллилитра ледяного изоляционного раствора. Повторите эту процедуру четыре раза.

Затем в одном миллилитре ледяного изолирующего раствора аккуратно проведите по артериальным сегментам полированной задней пипеткой. От 10 до 20 раз освободите отдельные гладкомышечные клетки брыжеечной артерии. Периодически проверяйте внешний вид миоцитов, помещая каплю клеточной суспензии на 35-миллиметровую тарелку и рассматривая их под микроскопом.

Здоровые ММК МА должны иметь гладкий удлиненный вид. Затем перенесите примерно от 100 до 200 микролитров клеточной суспензии в записывающую камеру с помощью полированной пипетки и дайте клеткам прилипнуть в течение 15 минут. На этом этапе заполните кончик патч-пипетки амфотерицином В, освободите внутренний раствор, опустив в него наконечник пипетки.

Затем примените отсасывание с другого конца с помощью шприца объемом 10 миллилитров, прикрепленного через кусок трубки, добавьте сверху раствор для пипетки, содержащий раствор пипетки. Используйте наконечник для дозатора einor micro loader до тех пор, пока пипетка не будет заполнена раствором примерно наполовину. Удалите пузырьки воздуха, осторожно постукивая по пипетке.

После этого вставьте пипетку в держатель электрода. С помощью микроманипулятора опустите пипетку на поверхность удлиненного миоцита. Когда сопротивление пипетки увеличивается до 6-10 мегаом, примените всасывание для достижения гигагеройного уплотнения.

При этом установите удерживающее напряжение на ноль милливольт во время ожидания перфорации мембраны. Затем примените 100-миллисекундный шаг напряжения к плюс 10 милливольт, а затем к минус 10 милливольт. Используйте усилитель для компенсации быстродействующего переходного процесса емкости пипетки одновременно с появлением емкости всей ячейки.

Переходные процессы малые устойчивые положительные токи от 2 до 10 ПИКО ампер, чистые и амплитудные указывают на наличие функционального КВ семи каналов. Успешная перфорация амфотерицином B снизит сопротивление доступа до 35 мегаом или менее. Чтобы записать соотношение напряжения 7 кВ по току, примените пять секундных шагов напряжения к напряжениям в диапазоне от минус 84 мВ, при которых вероятность разомкнутости семи каналов кВ минимальна, до плюс 16 мВ, при которой вероятность разомкнутости семи каналов кВ достигает плато. Через пять секунд при каждом испытательном напряжении вернитесь к удерживающему напряжению при минус четырех милливольтах на 10 секунд.

При этой процедуре неплотно подвешивайте два заранее изготовленных тонких капроновых шва с каждой стороны. Прилегающая к стеклу канюля осторожно перенесла рассеченный сегмент брыжеечной артерии из рассекающей камеры в камеру миотрансплантата давления, удерживая один конец сегмента с помощью пары микрощипцов. Далее, визуализируя через подсвеченный рассекающий микроскоп, возьмитесь за один конец сегмента артерии и осторожно проведите им по левой стеклянной канюле.

Закрепите конец с помощью нейлоновых швов. Затем аккуратно промывайте просветную жидкость через установленный сосуд, чтобы удалить кровь и мусор. Клапан к левому шприцу затем следует закрыть таким образом, чтобы с этой стороны представлялся статический столб жидкости, относительно которого регулируется давление с правой стороны, с помощью микроманипулятора расположить подвижную правую стеклянную канюлю ближе к артериальному сегменту и натянуть на него правый конец сегмента.

Наконец, закрепите сегмент артерии нейлоновыми швами и отрежьте лишние нити швов. Теперь установите блок графика давления на предметный столик над микроскопом под давлением. Подсоедините напорную колонку к правой стороне графической камеры, а затем накройте камеру крышкой.

Постепенно поднимайте шприц объемом 10 миллилитров в течение 15 минут и проверяйте наличие утечек в сосуде до тех пор, пока датчик давления P one не покажет 80 миллиметров ртутного столба, при необходимости отрегулируйте расстояние между канюлями, расстояние должно быть отрегулировано таким образом, чтобы сегмент артерии под давлением был примерно прямым и образовывал плечообразный узор, где делаются завязки. Проверить жизнеспособность смонтированного сосуда путем переходного суперфузии с 60 миллимолярным хлоридом калия в течение 30 секунд. Жизнеспособный сосуд быстро сужается при добавлении хлорида калия и расширяется сразу после его вымывания.

Затем добавьте концентрированное исследуемое вещество в раствор для ванны, аккуратно пипетируйте его взад и вперед в конце камеры, чтобы смешать испытуемое вещество с раствором для ванны, получив соответствующую конечную концентрацию в камере объемом 10 миллилитров. Изменения объема в диаметре сосуда после добавления исследуемого вещества можно отслеживать на видеоизображении в режиме реального времени, а также на графике в окне анализа изображения во время проведения эксперимента. На этом рисунке показано семейство последовательных следов тока, зарегистрированных в ответ на шаги напряжения до лечения, как показано черным цветом, и после стабилизации в присутствии 100 наномолярного периона цинка в одном миоците брыжеечной артерии, как показано красным цветом, здесь представлены репрезентативные токи для контроля и для 100 наномолярного периона цинка.

Серыми полосами обозначен интервал времени, в котором измерялись усредненные амплитуды тока Для графиков напряжения тока ступенчатые напряжения обозначаются справа стрелками. Это временной ход усиления тока кВ семь кВ на 100 наномолярных перионов цинка, измеренный непрерывным напряжением зажима при минус 20 мВ. Показывать. Вот усредненные кривые напряжения тока, полученные из семи плотностей тока KV, зарегистрированных ранее во время лечения 100 наномолярным цинковым перионом, и во время лечения 10 микромолярами KV семиканального блокатора XC 9 9 1 ионом цинка индуцированная расслаблением брыжеечной артерии, предварительно суженной 100 пикомолярным аргинином вазопрессином.

На этом рисунке показан временной ход изменения внешнего диаметра сосуда в ответ на нанесение 100 пикомолярного аргинина вазопрессина с последующим применением 100 наномолярного иона цинка. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить артерии к выделению одиночных клеток или к давлению мио графическое измерение артериального сужения, реакции дилататора. Кроме того, следует знать, как регистрировать семь токов КВ изолированно от других токов в свежевыделенных артериальных миоцитах.