Изучение артериальной гладких мышц KV7 калиевых каналов функцию с помощью Patch Clamp электрофизиологии и давления Миография

Общая цель данной процедуры заключается в измерении активности калиевых каналов KV7 в свежедиссоциированных гладкомышечных клетках брыжеечной артерии и сопоставлении этих данных с измерениями диаметра артерии, зарегистрированными в физиологических условиях. Для этого сначала хирургическим путем удаляют сосудистую аркаду брыжейки крысы. На втором этапе проводят препарирование и очистку сегментов брыжеечных артерий.

Затем некоторые сегменты используются для изоляции отдельных гладкомышечных клеток с целью проведения электрофизиологических измерений калиевых токов KV семь методом патч-кламп. Заключительным этапом является канюляция неповрежденных артериальных сегментов для проведения измерений с помощью прессорной миографии с целью оценки сужения или расширения артерий в ответ на действие фармакологических модуляторов калиевых каналов KV семь. В конечном итоге сочетание электрофизиологии методом патч-кламп и прессорной миографии используется для того, чтобы показать, как повышение или снижение активности калиевых каналов KV семь влияет на сужение брыжеечных артерий.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как использование клонированных каналов, экспрессируемых в клеточных линиях, является то, что токи регистрируются в некультивируемых клетках, которые нативно экспрессируют данные каналы, а токи KV могут быть изолированы от других классов калиевых каналов, которые могут активироваться в тех же клетках. Метод прессорной миографии позволяет регистрировать функциональные ответы той же ткани, из которой выделяют клетки; этот метод является более чувствительным и физиологичным, чем другие препараты, такие как артериальные кольца или полоски артерий. Доктор Барет Мани, постдокторант моей лаборатории, продемонстрирует технику канюляции артерий и прессорную миографию, а доктор Люба Брюггеман, старший научный сотрудник моей лаборатории, продемонстрирует процедуры изоляции клеток и патч-кламп.

Для начала данной процедуры с помощью хирургических ножниц отсеките сегменты длиной от 10 до 12 сантиметров с обоих концов тонкого кишечника крысы. Затем изолируйте кишечник вместе с прилегающими сосудами. После этого закрепите сегмент тонкого кишечника булавками.

Растяните брыжейку по ближней стороне камеры так, чтобы основная ветвь верхней брыжеечной артерии находилась в центре, а последующие порядки ветвей расходились от центра. Затем, используя освещенный диссекционный микроскоп, установите булавки только в сегменты кишечника. Осторожно удалите жировую и соединительную ткани, окружающие артерии второго-четвертого порядков вблизи кишечника, с помощью микропинцета и ножниц.

Придерживайте соседние вены, чтобы облегчить удаление жировой и соединительной ткани и избежать излишнего растяжения артерий. Теперь перенесите два-три сегмента брыжеечной артерии в чашку для культивирования тканей объемом 35 мм, содержащую 2 мл ледяного раствора для изоляции. После этого поместите чашку на лед и разрежьте сегменты брыжеечной артерии на кусочки длиной 3–4 мм, используя пастеровскую пипетку с оплавленным концом.

Перенесите артериальные сегменты в стеклянный флакон, содержащий 2 мл предварительно нагретого до 37 °C изолирующего раствора. Затем инкубируйте их в течение 30 минут при 37 °C. По истечении 30 минут осторожно аспирируйте изолирующий раствор при 37 °C с помощью пастеровской пипетки.

Добавьте к нему два миллилитра подогретого раствора фермента, затем инкубируйте в течение 35 минут при 37 °C. Сразу после 35-минутной инкубации в растворе фермента поместите пробирку на лед, аспирируйте раствор фермента и добавьте два миллилитра ледяного изолирующего раствора. Повторите эту процедуру четыре раза.

Затем в одном миллилитре ледяного изолирующего раствора осторожно перемешайте сегменты артерий с помощью полированной пастеровской пипетки 10–20 раз, чтобы высвободить отдельные гладкомышечные клетки брыжеечной артерии. Периодически проверяйте внешний вид миоцитов, помещая каплю суспензии клеток на чашку диаметром 35 миллиметров и рассматривая их под микроскопом.

Здоровые гладкомышечные клетки (ГМК) основного ствола легкого должны иметь гладкий вытянутый вид. Затем с помощью полированной пастеровской пипетки перенесите примерно 100–200 µL клеточной суспензии в регистрирующую камеру и дайте клеткам прикрепиться в течение 15 минут. На этом этапе заполните кончик патч-пипетки внутренним раствором, содержащим амфотерицин B, погрузив кончик пипетки в него.

Затем создайте вакуум на другом конце с помощью шприца объемом 10 мл, подключенного через трубку, и добавьте раствор для пипетки сверху. Используйте микрозагрузочную пипетку до тех пор, пока пипетка не будет заполнена раствором примерно наполовину. Удалите все пузырьки воздуха, осторожно постучав по пипетке.

После этого вставьте пипетку в держатель электрода. С помощью микроманипулятора опустите пипетку к поверхности вытянутого миоцита. Когда сопротивление пипетки увеличится до 6–10 МОм, создайте вакуум для формирования гига-запечатывания (giga seal).

Одновременно с этим установите удерживающий потенциал на уровне 0 mV и дождитесь перфорации мембраны. Затем примените ступенчатые изменения потенциала длительностью 100 мс до +10 mV, а затем до -10 mV. Используйте усилитель для компенсации быстрого переходного процесса емкости пипетки, возникающего одновременно с появлением емкости всей клетки.

Кратковременные стабильные положительные токи от 2 до 10 pA, исходящие из амплитуды, указывают на наличие функциональных каналов KV7. Успешная перфорация с помощью амфотерицина B снизит сопротивление доступа до 35 МОм или менее. Для записи зависимости тока KV7 от напряжения подавайте пятисекундные ступеньки напряжения в диапазоне от -84 мВ, при котором вероятность открытия каналов KV7 минимальна, до +16 мВ, при котором вероятность открытия каналов KV7 достигает плато. После пяти секунд при каждом тестовом напряжении возвращайтесь к удерживающему напряжению -4 мВ на 10 секунд.

В данной процедуре на каждой стороне свободно подвешивают по две заранее заготовленные тонкие нейлоновые нити. Рядом со стеклянной канюлей осторожно переносят диссекированный сегмент брыжеечной артерии из камеры для диссекции в камеру для анализа давления миографта, удерживая один конец сегмента микропинцетом. Затем, используя подсвеченный диссекционный микроскоп, зажмите один конец сегмента артерии и аккуратно заведите его на левую стеклянную канюлю.

Закрепите конец с помощью нейлоновой шовной нити. Затем осторожно промойте просвет, пропустив жидкость через закрепленный сосуд, чтобы удалить кровь и остатки тканей. После этого закройте клапан левого шприца, чтобы с этой стороны образовался статический столб жидкости, относительно которого будет регулироваться давление с правой стороны; используя микроманипулятор, переместите подвижную правую стеклянную канюлю ближе к сегменту артерии и натяните правый конец сегмента на нее.

Наконец, зафиксируйте сегмент артерии нейлоновыми швами и обрежьте излишки нитей. Теперь установите блок регистрации давления на предметный столик микроскопа для микрофотографии под давлением. Подсоедините колонку давления к правой стороне камеры регистрации, после чего накройте камеру крышкой.

Постепенно поднимайте шприц объемом 10 мл в течение 15 минут, проверяя сосуд на наличие утечек, пока датчик давления P1 не покажет 80 мм ртутного столба. При необходимости отрегулируйте расстояние между канюлями; расстояние следует настроить таким образом, чтобы сегмент артерии под давлением был примерно прямым и образовывал плечеобразный изгиб в местах перевязки. Проверьте жизнеспособность закрепленного сосуда путем кратковременной суперфузии 60 мМ хлорида калия в течение 30 секунд. Жизнеспособный сосуд быстро сокращается при добавлении хлорида калия и немедленно расширяется после его вымывания.

Затем добавьте концентрированное исследуемое вещество в раствор ванны; аккуратно прокачайте его туда и обратно с помощью пипетки рядом с краем камеры, чтобы перемешать исследуемое вещество в растворе ванны и добиться соответствующей конечной концентрации в камере объемом 10 миллилитров. Изменения объема в диаметре сосуда после добавления исследуемого вещества можно отслеживать на видео в режиме реального времени, а также фиксировать в окне анализа изображений в ходе проведения эксперимента. На этом рисунке представлена группа последовательных кривых тока, зарегистрированных в ответ на ступени напряжения до воздействия (показаны черным цветом) и после стабилизации в присутствии 100 наномолярного zinc perion в одном миоците брыжеечной артерии (показаны красным цветом); здесь приведены репрезентативные токи для контроля и для 100 наномолярного zinc perion.

Серые полосы указывают временной интервал, в течение которого измерялись усредненные амплитуды тока. Для графиков зависимости тока от напряжения ступенчатые значения напряжения indicated справа стрелками. Представлена временная зависимость усиления тока KV7 под воздействием 100 nanomolar ионов цинка, измеренная с помощью непрерывного фиксации потенциала при -20 millivolts. Здесь приведены усредненные кривые зависимости тока от напряжения, полученные на основе плотностей тока KV7, зарегистрированных до, во время воздействия 100 nanomolar ионов цинка и во время воздействия 10 micromolar блокатора каналов KV7 XC 9 9 1. Показана релаксация брыжеечной артерии, предварительно сокращенной 100 picomolar аргинин-вазопрессином, индуцированная ионами цинка.

На этом рисунке показана временная динамика изменений внешнего диаметра сосуда в ответ на применение 100 пикомолярного аргинин-вазопрессина с последующим применением 100 наномолярных ионов цинка. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как подготавливать артерии для выделения единичных клеток или для измерения сократительных и расширяющих реакций артерий методом миографии под давлением. Кроме того, вы должны знать, как регистрировать токи KV семь изолированно от других токов в свежевыделенных миоцитах артерий.