Итерационные Оптимизация дуплексов ДНК для кристаллизации SeqA ДНК-комплексов

В этом эксперименте подробно описывается, как получить кристаллы дифракционного качества белка, связанного с ДНК, содержащего метилированный тандемный гем. ГАТК. Повторите, чтобы способствовать кристаллической упаковке белкового комплекса ДНК. Начните с рационального проектирования длины ДНК, расстояния между GATC и концов ДНК продолжайте с комплементарными одноцепочечными олигонуклеотидами для очистки ДНК, а затем анеле для формирования гемиметилированного дуплекса ДНК, затем смешайте очищенный seq A для формирования комплекса.

Затем найти оптимальные условия для выращивания кристаллов дифракционного качества комплекса белковой ДНК с помощью испытаний кристаллизации с использованием коммерческих разреженных матричных экранов. Продемонстрированные результаты. Поделитесь влиянием различной длины, расстояния между GATC и концов ДНК на дифракционное качество кристаллов ДНК CQ A.

Целью данной работы является получение дифракционных качественных кристаллов CK, связанных с ДНК, но она также может помочь понять общие переменные, которые необходимо учитывать при проектировании дуплексов ДНК ДНК для кристаллизации других белковых комплексов ДНК. В данном исследовании используется вариант регуляторных белков репликации ДНК. Ищите, который образует стабильные димеры и имеет укороченную область линкера между его изационными и ДНК-связывающими доменами.

Этот вариант ограничивает связывание ДНК тандемными повторами GATTC, разделенными исключительно одним витком на ДНК сначала трансформируют BBL 20 1D три клетки с плазмидой, кодирующей DEMETRIC seq A под контролем промоторной пластины T seven. Реакцию трансформации на агаровых планшетах LB, содержащих 100 мкг на миллилитр, ампициллине и помещении в бактериальный инкубатор на ночь. Выберите смешанные колонии и начните выращивание в небольших масштабах за одну ночь.

На следующее утро инокулятором вводят один литр культуры с 10 миллилитрами ночного посева. Когда культура находится в логарифмической фазе, добавьте два миллилитра 0,5 молярного IPTG, чтобы стимулировать выработку белка. Продолжайте инкубацию в течение трех часов в орбитальном шейкере с температурой 37 градусов Цельсия.

Затем соберите клетки центрифугированием при 3 300 G в течение 10 минут. Риз, приостановите клеточную палитру в очистке, буферизируйте ложь ультразвуком и очистите лизат центрифугированием при 39 000 G в течение 40 минут. Теперь загрузите S-надосадочную жидкость в гепариновую колонку, уравновешенную очистительным буфером.

Для элюирования белка CK. Используйте линейный градиент до одного молярного элюирования белка хлорида натрия CK на уровне около 0,7 молярного хлорида натрия. Вытяните CK, содержащие фракции, и разбавьте, чтобы снизить ионную силу образца.

Затем загрузите образец в колонку катионобменной хроматографии Е, приравненную к очистительному буферу. Примените линейный градиент соли для петли чистого белка CK при концентрации около 0,4 молярного хлорида натрия. Соедините КФК, содержащие фракции.

Сконцентрируйте до трех миллиграмм на миллилитр и уберите на хранение. Дизайн буфера комплементарных неметилированных и метилированных олигонуклеотидов. Подготовьте образцы по одному микромолю каждой лиофилизированной одноцепочечной ДНК в 800 микролитрах автоклава, дважды дистиллированной воде вихревую и отложите на 15 минут теперь и 800 микролитров.

Предварительно разогрев два раза загрузкой буфера в каждый образец на 20-30 нуклеотидов длинных олигонуклеотидов готовят большой 10%-ный денатурирующий гель. После полимеризации снимите расческу и тщательно промойте лунку. Соберите гель, заполнив верхний и нижний резервуары одноразовым буфером TBE.

Предварительно запустите гель при напряжении 750 вольт, чтобы разогреть гель до 55 градусов Цельсия. Затем остановите прогон и тщательно промойте лунки с проточным буфером. Теперь нагрейте олигонуклеотиды до 90 градусов Цельсия в течение двух минут.

Вихрь и вращение. Образцы немедленно приступают к загрузке геля. Запустите гель при напряжении около 700 вольт, пока олигонуклеотид не мигрирует.

На полпути: На 10% полиакриламидном геле alph фенол синий co мигрирует с олигонуклеотидами длиной около 20 оснований и ксилолом длиной около 60 оснований. Разберите гель из аппарата и снимите распорки на ровной поверхности. Снимите одну стеклянную пластину и накройте гель полиэтиленовой пленкой.

Затем переверните гель, снимите другую стеклянную пластину и накройте гель полиэтиленовой пленкой. Затем отметьте полосы с помощью ультрафиолетового света и флуоресцентной пластины за гелем. Чтобы увидеть тень ДНК лезвием бритвы, вырежьте ленту и разрежьте ее на мелкие кусочки.

Переложите каждый образец в стерильную пробирку объемом 15 миллилитров. Добавьте девять миллилитров элуцианского буфера и разведите на ночь при температуре 37 градусов Цельсия с перемешиванием. Осторожно переложите раствор в автоклавную центрифужную пробирку с помощью наконечника для пипетки с загрузкой гелем.

Чтобы избежать переноса кусочков акриламида, добавьте один миллилитр трех миллилитров ацетата натрия с pH 7 плюс 25 миллилитров охлажденного 100% этанола, инкубируйте при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение не менее трех часов. Центрифугируйте осажденную ДНК. Затем высушите пеллеты на скоростном пылесосе при среднем нагреве, ресуспендируйте каждую гранулу в 400 микролитрах автоклава, дважды дистиллированной воде и переложите в свежую пробирку.

Добавьте 40 микролитров трех моляров ацетата натрия при pH 7 и один миллилитр 100% этанола и инкубируйте в течение 30 минут при температуре минус 20 градусов Цельсия после центрифугирования в течение 15 минут при 18 000 раз. G, промойте гранулы ДНК 100 микролитрами 70% холодного этанола, чтобы удалить остатки соли в течение шести минут при 18 000 раз. Затем выбросьте этанол и высушите гранулы на скоростном пылесосе.

Теперь повторно отправьте каждую гранулу в 100 микролитров автоклава двойной дистиллированной воды. Определение концентрации олигонуклеотидов методом спектрометрии. Для получения гемиметилированных дуплексов ДНК сначала смешивают равные моло-концентрации комплементарных одиночных цепей.

Затем нагрейте смеси до 95 градусов Цельсия на водяной бане в течение пяти минут, чтобы обезвредить пряди. Дайте образцам медленно остыть до комнатной температуры внутри водяной бани. Объедините равные объемы 81 микромольной очищенной CQ белка и 81 микромольной метилированной ДНК.

Затем выдерживают комнатную температуру в течение 15 минут. Хранить при температуре четыре градуса Цельсия до использования экрана для условий кристаллизации с использованием коммерческих разреженных матричных сит. После того, как первоначальные кристаллизационные провода были идентифицированы, оптимизируйте условия для выращивания кристаллов дифракционного качества, чтобы защитить полученные кристаллы ДНК CK.

Либо увеличьте количество PEG 400, присутствующего в кристаллизационном растворе, до конечной концентрации 25%, либо добавьте 20% глицерина в кристаллизационный раствор. Вычерпните отдельные кристаллы с помощью нейлоновой петли. Заморозьте образцы в жидком азоте.

Теперь проверьте дифракционный предел каждого кристалла при 100 К. Чтобы получить кристаллическую структуру укороченного мутанта CK, связанного с метилированной Hemi ДНК, мы последовательно оптимизируем три параметра ДНК: расстояние между метилированными последовательностями Hemi GETC, длину дуплекса и отсутствие или наличие пяти основных выступов. В этом исследовании использовался вариант поиска ДМО с точечной мутацией в конечном терминальном домене, которая предотвращает дальнейшую лигментизацию, и укороченным линкером, который ограничивает связывание ДНК с тандемом.

Повторы GATC, разделенные исключительно одним витком на ДНК: анализ сдвига электромобильности указывает на то, что модифицированный белок CK преимущественно связывает повторы GATC, разделенные девятью-10 парами оснований. Таким образом, в первоначальных экранах используются дуплексы длиной от 23 до 24 пар оснований, содержащие две метилированные кромки. Повторы GATC разделены девятью или 10 парами оснований.

Три дуплекса дали кристаллы красивой формы. При этом ни один из кристаллов не разломился до высокого разрешения. Данные показали, что разделение A-G-A-T-C девяти пар оснований было предпочтительным для кристаллизации, неожиданно усиливая взаимодействие в канавке за счет включения CG-динуклеотида между двумя сайтами GATTC, не изменяло дифракционный предел кристаллов.

Напротив, оптимизация длины выступов резко изменила молекулярные контакты и морфологию кристаллов. Кристаллическая структура этого белка CK, связанного с метилированным дуплексом ДНК, подтвердила, что свободная сторона дуплекса ДНК не участвует в контактах кристаллов несмотря на относительный размер белка и ДНК, большинство взаимодействий между партнерами симметрии опосредованы взаимодействиями белка, белка и белка ДНК. Интересно, что в данном конкретном случае положительный эффект выступа из пяти простых динуклеотидов не связан с образованием псевдонепрерывной ДНК.

Вместо этого пять основных концов метилированной цепи выступают в сторону от осей ДНК и взаимодействуют с проксимальной молекулой CK комплекса, что объясняет, почему для изменения кристаллической упаковки строго требуются два нуклеотида. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очищать белки и конструировать дуплексы ДНК для кристаллизации комплекса белковой ДНК. Важно помнить, что, несмотря на то, что этот протокол был устройством для кристаллизации комплекса ДНК CK, рациональная оптимизация длины последовательности и концов ДНК обеспечивает общую основу для проектирования дуплексов ДНК для кристаллизации других белковых комплексов ДНК.