Итерационные Оптимизация дуплексов ДНК для кристаллизации SeqA ДНК-комплексов

В данном эксперименте подробно описано, как получить кристаллы белка, связанного с ДНК, содержащей тандемный гемиметилированный участок GATC, с качеством, подходящим для дифракции. Повторите процедуру, чтобы способствовать плотной упаковке кристаллов белково-ДНК-комплекса. Начните с рационального проектирования длины ДНК, расстояния между GATC и концов ДНК, затем используйте комплементарные одноцепочечные олигонуклеотиды для очистки ДНК и последующего отжига для формирования гемиметилированного дуплекса ДНК, после чего добавьте очищенный белок seq A для образования комплекса.

Затем подберите оптимальные условия для выращивания кристаллов комплекса белка с ДНК дифракционного качества, используя коммерческие наборы разреженных матриц для скрининга кристаллизации. Продемонстрированные результаты. Опишите влияние изменения длины ДНК, интервалов GATC и концов цепей на дифракционное качество кристаллов CQ A DNA.

Целью данной работы является получение кристаллов CK, связанных с ДНК, подходящих для дифракционного анализа; кроме того, работа поможет определить общие переменные, которые необходимо учитывать при разработке дуплексов ДНК для кристаллизации других белково-нуклеиновых комплексов. Данная процедура будет использоваться в работе Chang, A, докторанта из моей лаборатории. В этом исследовании используется вариант регуляторных белков репликации ДНК, который образует стабильные димеры и имеет укороченную линкерную область между доменами олигомеризации и связывания с ДНК.

Этот вариант ограничивает связывание ДНК тандемными повторами GATC, разделенными строго одним витком ДНК. Сначала трансформируйте клетки BBL 20 1D тремя плазмидами, кодирующими DEMETRIC seq A под контролем T7-промотора. Высейте реакционную смесь трансформации на чашки с агаром LB, содержащим 100 µg/mL ампициллина, и поместите в бактериологический инкубатор на ночь. Отоберите смешанные колонии и создайте маломасштабную ночную культуру.

На следующее утро инокулируйте один литр культуры, добавив 10 мл ночного инокулята. Когда культура достигнет логарифмической фазы роста, добавьте два мл 0,5 М IPTG для индукции экспрессии белка. Продолжайте инкубацию в течение трех часов в орбитальном шейкере при температуре 37 °C.

Затем соберите клетки путем центрифугирования при 3 300 G в течение 10 минут. Ресуспендируйте клеточный осадок в очищающем буфере A, проведите соникацию и очистите лизат путем центрифугирования при 39 000 ×g в течение 40 минут. Теперь нанесите полученный супернатант на гепариновую колонку, уравновешенную очищающим буфером.

Для элюции белка CK используйте линейный градиент до 1 M NaCl; белок CK элюируется при концентрации NaCl около 0,7 M. Соберите фракции, содержащие CK, и разбавьте их для снижения ионной силы образца.

Затем нанесите образец на колонку для катионообменной хроматографии, уравновешенную очищающим буфером. Примените линейный градиент соли для элюции чистого белка CK при концентрации хлорида натрия около 0,4 M. Объедините фракции, содержащие CK.

Доведите концентрацию до 3 mg/mL и поместите на хранение. Дизайн буфера: комплементарные неметилированные и метилированные олигонуклеотиды. Приготовьте образцы, растворив по 1 µmol каждого лиофилизированного одноцепочечного ДНК в 800 µL автоклавированной дважды дистиллированной воды; перемешайте на вортексе и оставьте на 15 минут, а затем добавьте 800 µL.

Добавьте предварительно нагретый двухкратный буфер для нанесения проб в каждый образец. Для олигонуклеотидов длиной от 20 до 30 нуклеотидов приготовьте большой 10% денатурирующий гель. После полимеризации извлеките гребенку и тщательно промойте лунки. Соберите систему, заполнив верхний и нижний резервуары однократным рабочим буфером TBE.

Проведите предварительный электрофорез геля при 750 В, чтобы разогреть его до 55 °C. Затем остановите процесс и тщательно промойте лунки рабочим буфером. После этого нагрейте олигонуклеотиды до 90 °C в течение двух минут.

Перемешайте на вортексе и центрифугируйте. Образцы следует немедленно нанести на гель. Проводите электрофорез при напряжении около 700 вольт до тех пор, пока олигонуклеотид не мигрирует.

На 10% полиакриламидном геле альфа-феноловый синий сомигрирует с олигонуклеотидами длиной около 20 оснований, а ксиленол-циан-FF — с олигонуклеотидами длиной около 60 оснований. Извлеките гель из аппарата и снимите прокладки на плоской поверхности. Снимите одну стеклянную пластину и накройте гель пищевой пленкой.

Затем переверните гель, снимите вторую стеклянную пластину и накройте гель пищевой пленкой. После этого отметьте полосы, используя УФ-свет и флуоресцентную пластину, помещенную за гелем. Чтобы видеть тень ДНК, вырежьте полосу лезвием и разделите ее на мелкие фрагменты.

Перенесите каждый образец в стерильную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 9 мл элюирующего буфера и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при перемешивании. Осторожно перенесите раствор в центрифужную пробирку для автоклавирования, используя наконечник пипетки для нанесения образцов в гель.

Чтобы избежать переноса фрагментов акриламида, добавьте 1 mL 3 M ацетата натрия (pH 7) и 25 mL охлажденного 100% этанола, затем инкубируйте при -20 °C не менее трех часов. Центрифугируйте осадок ДНК. После этого высушите пеллеты в вакуум-концентраторе (speed vac) при среднем нагреве, ресуспендируйте каждый пеллет в 400 µL автоклавированной дважды дистиллированной воды и перенесите в новую пробирку.

Добавьте 40 µL 3 M ацетата натрия (pH 7) и 1 mL 100% этанола, перемешайте на вортексе и инкубируйте в течение 30 минут при -20 °C. После центрифугирования в течение 15 минут при 18 000 ×g промойте осадок ДНК 100 µL холодного 70% этанола для удаления остатков солей, центрифугируйте в течение 6 минут при 18 000 ×g, затем удалите этанол и высушите осадок в вакуум-концентраторе.

Теперь ресуспензируйте каждый осадок в 100 µL дважды дистиллированной автоклавированной воды. Определите концентрацию олигонуклеотидов с помощью спектрометрии. Для подготовки полуметилированных дуплексов ДНК сначала смешайте равные молярные концентрации комплементарных одноцепочечных нитей.

Затем нагрейте смеси до 95 °C на водяной бане в течение пяти минут для денатурации цепей. Дайте образцам медленно остыть до комнатной температуры непосредственно в водяной бане. Смешайте равные объемы очищенного белка CQ в концентрации 81 µM и полуметилированной ДНК в концентрации 81 µM.

Затем инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Храните при температуре 4 °C до использования; для подбора условий кристаллизации используйте коммерческие наборы для разреженного матричного скрининга. После выявления первоначальных условий кристаллизации оптимизируйте их для выращивания кристаллов, пригодных для дифракции. Криопротектируйте полученные кристаллы CK DNA.

Либо увеличьте количество PEG 400 в кристаллизационном растворе до конечной концентрации 25%, либо добавьте в кристаллизационный раствор 20% глицерина. Извлеките отдельные кристаллы с помощью нейлоновой петли. Заморозьте образцы в жидком азоте.

Теперь проверьте дифракционный предел каждого кристалла при 100 k. Чтобы получить кристаллическую структуру укороченного мутанта CK, связанного с гемиметилированной ДНК, мы последовательно оптимизируем три параметра ДНК: расстояние между гемиметилированными последовательностями GATC, длину дуплекса, а также наличие или отсутствие 5'-выступающих концов. В данном исследовании используется вариант DME seek a с точечной мутацией в концевом терминальном домене, которая предотвращает дальнейшую лигирование, и укороченный линкер, ограничивающий связывание ДНК тандемом.

Анализы сдвига электрофоретической подвижности ДНК показали, что повторы GATC, разделенные ровно одним витком, свидетельствуют о том, что модифицированный белок CK преимущественно связывается с повторами GATC, разделенными девятью или 10 парами оснований. Следовательно, для первичного скрининга используются дуплексы длиной от 23 до 24 пар оснований, содержащие два гемиметилированных повтора GATC, разделенных девятью или 10 парами оснований.

Три дуплекса дали кристаллы хорошей формы. Хотя ни один из кристаллов не дифрактовал с высоким разрешением, данные указали на то, что для кристаллизации предпочтительным было разделение A-G-A-T-C длиной в девять пар оснований; при этом неожиданное усиление взаимодействий в бороздке и остове за счет включения CG-динуклеотида между двумя сайтами GATC не изменило предела дифракции кристаллов.

Напротив, оптимизация длины выступающих концов привела к резкому изменению молекулярных контактов и морфологии кристаллов. Структура кристалла этого белка CK, связанного с полуметилированным дуплексом ДНК, подтвердила, что свободная грань дуплекса ДНК не участвует в кристаллических контактах, несмотря на относительный размер белка и ДНК; большинство взаимодействий между симметричными партнерами опосредованы белок-белковыми и белок-ДНК взаимодействиями. Интересно, что в данном конкретном случае благоприятный эффект от динуклеотидного выступа на 5'-конце не обусловлен формированием псевдонепрерывной ДНК.

Напротив, 5'-конец метилированной цепи отходит от оси ДНК и взаимодействует с проксимальной молекулой CK комплекса, что объясняет, почему для изменения кристаллической упаковки строго требовалось два нуклеотида. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как очищать белки и конструировать дуплексы ДНК для кристаллизации белково-нуклеиновых комплексов. Важно помнить, что, хотя данный протокол был разработан для кристаллизации комплекса CK-ДНК, рациональная оптимизация длины, последовательности и концов ДНК представляет собой общую основу для проектирования дуплексов ДНК с целью кристаллизации других белково-нуклеиновых комплексов.