Бляшек на мышиной норовирус

Общая цель данной процедуры — количественное определение инфекционных частиц норовируса нейронов. Для этого сначала готовят десятикратные разведения вирусного инокулята. На втором этапе разведения вирусного инокулята переносят на монослой raw 2 6 4 0.7 и инкубируют планшеты в качалке при комнатной температуре в течение одного часа.

Затем аспирируют инокулят, наносят слой смеси в соотношении один к одному из среды для формирования бляшек и 2X MEM, и инкубируют планшеты в течение 48 часов в инкубаторе для культур тканей. Заключительным этапом является нанесение окрашивающего раствора нейтрального красного и инкубация планшетов от одного до трех часов в инкубаторе для культур тканей. В итоге окрашивающий раствор нейтрального красного аккуратно аспирируют, не удаляя агарозный слой, после чего подсчитывают бляшки с помощью лайтбокса.

Данный метод количественного определения инфекционных вирусных частиц может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения норовирусов, такие как количество инфекционных частиц, выделяемых с фекалиями, или определение тканей, поддерживающих инфекцию. Как правило, лицам, которые впервые используют этот метод, бывает трудно поддерживать жизнеспособность клеток на протяжении всего анализа. Визуальная демонстрация данного метода крайне важна, так как принцип анализа методом бляшек для зеркального норовируса может быть труден для понимания людьми без соответствующего опыта.

Успешное завершение данного анализа представляет собой совокупность последовательных этапов, требующих определенного количества клеток, соблюдения температурного режима и точного выполнения манипуляций для четкого наблюдения бляшек. Сначала изучите монослой клеток под световым микроскопом, чтобы проверить их морфологию. Большинство клеток должны иметь округлую форму.

Не допускайте чрезмерного разрастания клеток, так как в этом случае они обычно не образуют бляшек. Для проведения анализа бляшек вируса Мурна (Murn neurovirus) на почти слившемся слое клеток 2 6 4 0.7 в флаконе для культивирования тканей объемом 175 см² удалите среду из флакона и добавьте к клеткам 10 мл свежей среды DMEM 10. Затем снимите клетки со дна флакона с помощью скребка для клеток, после чего с помощью пипетки объемом 10 мл несколько раз аспирируйте и выдувайте клеточную суспензию струей на дно флакона. Повторите это действие не менее трех раз, чтобы разрушить все клеточные агрегаты.

Для использования в маточной колбе. Отберите от одного до двух миллилитров клеточной суспензии и перенесите ее в новую колбу объемом 175 см², содержащую от 33 до 34 мл DMEM 10. Инкубируйте колбу в инкубаторе для культур тканей при 37 °C и 5% CO2 в течение двух-трех дней, после чего снова проведите пассирование.

Перед посевом клеток на планшеты для анализа доведите плотность клеточной суспензии до 1 × 10⁶ жизнеспособных клеток на миллилитр в среде DMEM 10 и добавьте по 2 мл этой суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета диаметром 3,5 см. Закройте планшет. Затем сразу же 10 раз аккуратно покачайте планшет вручную, чтобы равномерно распределить клетки по лункам.

Не допускайте образования выпуклости (линзы) на планшете, так как это приведет к скоплению клеток в центре лунки. Затем поместите планшет в инкубатор для культур тканей минимум на четыре часа, а лучше на ночь, чтобы клетки прикрепились. Вирусный инокулят можно получить из гомогенизированных тканей или образцов фекалий мышей, инфицированных MNV. При использовании образцов тканей поместите кусочек ткани размером с горошину в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл, содержащую стерильные силикатные бусины и 1 мл DMEM 10, и проведите гомогенизацию.

Магнетизатор используют при 6 000 RPM в течение одной минуты. При использовании образцов фекалий гомогенизируют не более трех фекальных пеллет аналогичным способом, замораживают гомогенизированные образцы при минус 80 °C и размораживают инокулят в день проведения анализа на образование бляшек. С помощью многоканального дозатора в каждую лунку 24-луночного планшета вносят 1,35 мл DMEM five, затем в первую лунку планшета дозируют 0,15 мл третьего вирусного инокулята.

Выполните десятикратные серийные разведения: отберите 0,15 мл первого разведения 10⁻¹ и перенесите в вторую лунку планшета для получения разведения 10⁻². Затем повторите этот процесс, используя разведение из второй лунки, чтобы получить разведение 10⁻³. Обратите внимание, что в зависимости от образца может потребоваться дальнейшее разведение до 10⁻⁹.

После приготовления последовательных разведений промаркируйте планшеты с клетками RAW 264.7 при слиянии 60–80%, указав названия образцов и используемые разведения. Затем удалите всю среду из одного из планшетов путем аспирации или выливания и добавьте 0,5 миллилитра разведенного образца в лунку. Повторите процедуру для дублирующей лунки, после чего переходите к следующему, более низкому разведению.

После того как все три разведения были добавлены на одну планшетку в двух повторах, наклоните планшетку вперед и назад, чтобы убедиться, что все клетки покрыты. Повторите процедуру со следующей планшеткой клеток. Когда все планшетки будут обработаны, поместите их на качалку, настроенную примерно на 18 колебаний в минуту, на один час при комнатной температуре; в микроволновой печи разогрейте флакон предварительно приготовленного и/или автоклавированного агароза до полного расплавления.

Затем поместите расплавленный агар в водяную баню с температурой 42 °C для термостатирования. Далее смешайте расплавленный агар со стерильной двойной средой XMEM в стерильном флаконе в соотношении один к одному. Поместите флакон с этим раствором покрытия в водяную баню с температурой 37 °C до начала использования.

По окончании одночасовой инкубации аспирируйте инокулят из каждой лунки и медленно добавьте в каждую лунку два миллилитра раствора для перекрытия, прижимая кончик пипетки к стенке лунки. Чтобы избежать смещения клеток, накройте планшеты и дайте слою перекрытия затвердеть в течение примерно 10 минут при комнатной температуре. Затем перенесите планшеты в инкубатор для культур тканей на 48 часов.

После завершения периода инкубации проверьте планшеты на наличие бляшек. Если бляшки не видны, верните планшеты в инкубатор и проверьте их снова через четыре часа. При необходимости повторите процедуру, однако общая продолжительность инкубации не должна превышать 72 часов.

Сначала приготовьте раствор для окрашивания нейтральным красным. Затем добавьте по два миллилитра раствора нейтрального красного в каждую лунку; для данного протокола пробку aros удалять не нужно. Инкубируйте планшеты при 37 °C в течение одного часа.

По истечении времени инкубации проверьте планшеты на наличие бляшек, не сливая раствор нейтрального красного из лунок. Если окрашивание не проявилось, инкубируйте планшеты еще в течение одного часа, но не более трех часов в общей сложности. Как только бляшки станут видимыми, аспирируйте раствор нейтрального красного, стараясь не задеть пробку из агарозы, после чего приступите к подсчету бляшек.

Осмотрите планшеты и определите разведение, при котором бляшки четко отделены друг от друга. Поместите планшет на лайтбокс и подсчитайте бляшки, отмечая каждую подсчитанную точку, чтобы избежать повторного учета.

Затем повторите подсчет в лунке с другим разведением вируса и рассчитайте вирусный титр в бляшкообразующих единицах на миллилитр. Согласно инструкциям в письменном протоколе, на этом репрезентативном изображении показан монослой до инфицирования. Клетки raw 2 6 4 0.7 культивировали в течение ночи и визуализировали с помощью светового микроскопа при 20-кратном увеличении.

На данном изображении показан тот же монослой после образования бляшек. Клетки были окрашены 0,01% раствором нейтрального красного через 48 часов после инфицирования и визуализированы с помощью светового микроскопа при четырехкратном увеличении. Римские цифры один, две и три указывают на три видимые бляшки.

На этом изображении показан планшет по завершении протокола метода агаровых диффузионных тестов (plaque assay) с дубликатными лунками трех десятикратных разведений. Лунки, обозначенные римскими цифрами I и IV, соответствуют разведению 10⁻¹, лунки II и V соответствуют разведению 10⁻², а лунки III и VI соответствуют разведению 10⁻³.

Титр вируса в образце указан ниже. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости смены наконечников дозатора между разведениями во избежание перекрестного загрязнения образцов, доведении растворов до нужной температуры и недопущении высыхания монослоев клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как проводить анализ по методу образования бляшек и количественно определять количество инфекционных частиц нейровируса мыши.

Не забывайте, что при работе с норовирусом Mira в боксе биологической безопасности при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и халата, а отходы должны быть утилизированы надлежащим образом в соответствии с правилами, установленными вашим местным комитетом по биобезопасности.