Синтез Фазовый наноэмульсии с узким распределением размера для акустической испарения капель и Bubble повышенной ультразвуковой аблации-опосредованной

Общая цель следующего эксперимента заключается в наблюдении влияния пузырьков, генерируемых акустическим испарением наноэмульсий с липидным покрытием, на опосредованную ультразвуком абляцию. Это достигается путем предварительного распределения наноэмульсий с липидным покрытием по всему объему полиакриламидных гидрогелей, нагруженных альбумином. На втором этапе с помощью фокусирующего преобразователя в гидрогель подаются короткие высокоамплитудные импульсы, которые вызывают локальное испарение наноэмульсий в фокусе; затем образовавшиеся пузырьки непрерывно воздействуются ультразвуком, и акустическая энергия, излучаемая пузырьками, быстро поглощается гидрогелем, что ускоряет темп опосредованного ультразвуком нагрева.

Результаты показывают, что присутствие пузырьков резко сокращает время и энергию, необходимые для нагрева гидрогеля выше пороговой температуры денатурации белков, что приводит к более быстрому и эффективному ультразвуковой абляции. Размер наноэмульсии с фазовым переходом является критическим определяющим фактором порога давления. Для акустического испарения нами был разработан протокол получения стабильных наноэмульсий с фазовым переходом с узким распределением по размеру и четко определенными порогами испарения, а также система in vitro для оценки влияния на ультразвуковую абляцию среды.

Несмотря на описание системы in vitro, наноэмульсии фазового перехода предназначены для визуализации экстраваскулярных тканей и солидных опухолей с помощью частиц, которые могут быть испарены акустически. Образующиеся пузырьки затем могут быть использованы в диагностических или терапевтических целях при лечении рака. Чтобы начать процедуру приготовления наноэмульсии фазового перехода (PSNE), сначала смешайте липиды: растворите 11 mg DPPC и 1.7 mg DSPE.

Поместите Peg 2000 в хлороформе в стеклянную круглодонную колбу. Поместите круглодонную колбу в водяную баню при 50 °C в вытяжном шкафу и используйте поток газа Argonne для испарения органического растворителя. Для формирования сухой липидной пленки поместите колбу в эксикатор и оставьте под вакуумом на ночь, чтобы к следующему утру липидная пленка полностью высохла.

Регидратируйте липидную пленку, добавив 5,5 milliliters PBS. Нагревайте раствор на водяной бане при 45 °C до полного растворения липидной пленки. Периодически переносите липидный раствор в флакон объемом семь milliliter, после чего подвергайте его воздействию ультразвука с помощью ультразвукового зонда в течение двух минут при амплитуде 20%.

Разделите раствор между двумя флаконами по 2.5 milliliters в каждом. Оставшиеся 0.5 milliliters утилизируют. Добавьте по 2.5 milliliters PBS в каждый флакон, а затем поместите оба флакона в ледяную водяную баню при температуре 0 °C.

Добавьте 50 µL декафторпентана, или DDFP, в каждый флакон. Смешайте DDFP с липидной смесью. Охлаждение в ледяной водяной бане является наиболее критическим этапом данной процедуры.

Ледяная водяная баня используется для предотвращения испарения жидкого перфторуглерода. В ходе этого процесса подвергайте каждый флакон ультразвуковой обработке в ледяной водяной бане при следующих настройках: амплитуда 25%, импульсный режим, общее время — 60 секунд. После соникации перенесите раствор PSNE в сцинтилляционные флаконы объемом 20 миллилитров, добавив в каждый флакон пять миллилитров PBS, чтобы конечный объем составил 10 миллилитров на флакон.

Соберите экструдер в соответствии с инструкциями производителя для его подготовки к работе. Пипеткой внесите 10 milliliters деионизированной воды в верхний порт для образца. Закройте отверстие крышкой и затяните вентиляционный клапан.

Медленно откройте линию подачи азота для повышения давления, чтобы продавить образец через мембраны. Соберите образец из выходной трубки, пропустите PSNE через фильтр с размером пор 100 nanometer или 200 nanometer 16 раз для получения узкого распределения по размерам. Начните эту процедуру с приготовления полиакриламидного гидрогеля, содержащего PSNE.

Сначала приготовьте 24% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA), растворив 2,4 грамма порошка BSA в 10 миллилитрах деионизированной воды. Затем приготовьте 10% раствор персульфата аммония (PS), разводя один грамм порошка PS в 10 миллилитрах деионизированной воды. Смешайте эти реагенты в пластиковой форме в следующем порядке: 2,1 миллилитра раствора акриламида, 1,2 миллилитра Трис-буфера, 0,1 миллилитра 10% раствора PS, 4,5 миллилитра 24% раствора BSA и 3,6 миллилитра деионизированной воды. Нагрейте раствор до 40 °C на водяной бане, затем поместите его в вакуум на один час для дегазации жидкости.

Это необходимо, чтобы избежать нежелательного образования пузырьков в гидрогеле спустя час. Извлеките образец из вакуума, добавьте 480 µL суспензии PSNE и тщательно перемешайте, аккуратно вращая пластиковую камеру. В вытяжном шкафу добавьте 12 µL тетраэтилэндиамина (TEMED) для полимеризации акриламида и поместите камеру в водяную баню при температуре 12 °C на два часа.

Полимеризация является экзотермическим процессом, поэтому для предотвращения испарения PSE во время полимеризации необходима охлаждающая баня. После полимеризации акриламида установите фокусирующий силовой преобразователь и визуализирующий датчик в акриловый резервуар, заполненный деионизированной водой с DGA, так, чтобы плоскость визуализации совпадала с фокальным объемом преобразователя. Затем поместите полиакриламидный гидрогель, содержащий PSNE, в фокус силового преобразователя; испарите PSNE внутри гидрогеля с помощью коротких акустических импульсов, после чего примените непрерывное воздействие волной в течение 15 секунд для усиления абляции за счет образования пузырьков.

По мере денатурации BSA гидрогель становится непрозрачным из-за поглощения ультразвука и выделения тепла, что позволяет контролировать испарение и образование пузырьков с помощью диагностического ультразвукового сканера. На данном примере изображения стрелка указывает на фокальную область, в которой образовалось облако пузырьков в результате испарения PSNE. Повторите акустическое воздействие в новом месте в гидрогеле, чтобы повысить уровень PSNE и сравнить время и объем абляции.

Данный протокол позволяет получить покрытые липидами перфторуглеродные капли с узким распределением по размеру. Здесь представлено распределение по размеру, измеренное методом динамического рассеяния света для PSNE, подвергнутых экструзии через фильтры с порами 100 и 200 нанометров. Единицы измерения по оси ординат основаны на интенсивности света, рассеянного частицами определенного размера, относительно общей интенсивности рассеянного света от образца.

При измерении среднего диаметра и стандартного отклонения PSNE через один и семь дней после экструзии через фильтры с порами 100 и 200 нанометров методом динамического рассеяния света результаты показывают, что PSNE остаются стабильными в течение как минимум одной недели. На данном рисунке представлены изображения PSNE в B-режиме до и после испарения. В полиакриламидном гидрогеле стрелка указывает на фокальную область, в которой в результате испарения PSNE образовалось облако пузырьков.

На данных изображениях представлен полиакриламидный гидрогель, содержащий альбумин и PSNE, до и после испарения и соникации с помощью высокоинтенсивного фокусированного ультразвука (HIFU). Повреждение формируется в результате 15 секундного нагрева под воздействием HIFU. Асимметричная форма повреждения является следствием предфокального нагрева, который возникает из-за наличия облака пузырьков на пути ультразвука. Предфокальный нагрев и образование повреждений вследствие рассеяния ультразвука на пузырьках могут быть минимизированы путем снижения передаваемой акустической мощности после их возникновения.

Данный метод получения стабильных фазопереходных наноэмульсий позволит исследователям в области терапии с применением ультразвука изучить возможности усиления абляции методом HIFU за счет образования пузырьков в солидных опухолях. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать стабильные фазопереходные наноэмульсии с узким распределением частиц по размеру, а также изучать нуклеацию пузырьков и усиленную ультразвуковую абляцию.