Одновременное внутриклеточной регистрации мотонейронов поясничного и силы, возникающей в ее мотор в взрослой мыши В естественных условиях

Общая цель данной процедуры — изучить электрофизиологические и сократительные свойства отдельного двигательного звена мыши путем проведения внутриклеточных записей моторных нейронов in vivo. Для этого сначала обнажают спинной мозг и интересуемую мышцу, после чего к сухожилию мышцы прикрепляют датчик силы.

Затем мотонейрон стимулируют внутриклеточным электродом, вызывая сокращение регистрируемого двигательного звена. В итоге электрофизиологические свойства мотонейрона могут быть охарактеризованы одновременно с сократительными свойствами соответствующего двигательного звена. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы микрохирургического вмешательства очень трудно освоить из-за малого размера животного.

Для начала процедуры анестезируйте мышь, вводя пентобарбитал натрия или смесь кетамина и ксилазина внутрибрюшинно. Убедитесь в отсутствии рефлекса отщипывания пальца. Затем сделайте разрез над трахеей тупыми ножницами и раздвиньте кожу в обе стороны.

Затем аккуратно разорвите слюнную железу с помощью тупоконечных пинцетов. Чтобы обнажить две тонкие мышцы, покрывающие трахею, разведите эти мышцы в стороны. Для этого используйте пинцет Dumont №7.

Проденьте две нити шелкового шовного материала 4-0 под трахею. Затем сделайте поперечный разрез трахеи между двумя хрящевыми кольцами. Будьте осторожны, чтобы не пересечь трахею полностью.

Теперь введите трахеальную трубку в трахею. Зафиксируйте обе стороны отверстия в месте введения, завязав над ним швы. После этого подключите трахеальную трубку к вентилятору для мышей и капнографу.

Затем подключите аппарат ИВЛ к источнику чистого кислорода через комплаенс-мешок. Отрегулируйте параметры вентилятора таким образом, чтобы мышь не сопротивлялась искусственной вентиляции, а парциальное давление углекислого газа в конце выдоха оставалось стабильным в пределах от 4 до 5%. На этом этапе обнажите яремную вену с одной стороны шеи, используя метод тупой диссекции.

Яремная вена разделяется на два основных ствола: переднюю и заднюю лицевые вены. Осторожно отделите вену от окружающей ее соединительной ткани. Затем пропустите две нити шелкового шовного материала 6-0 под веной, расположив их как можно дальше друг от друга вдоль всей длины вены.

Затем установите маленький сосудистый зажим на проксимальный конец вены и перевяжите дистальный конец вены. С помощью очень тонких ирисных ножниц сделайте небольшой поперечный разрез в вене. Будьте очень осторожны, чтобы не пересечь вену полностью.

После этого введите предварительно заполненный катетер размера 1 French в отверстие до сосудистого зажима, фиксирующего вену и катетер вместе. Осторожно снимите сосудистый зажим. Затем продвиньте катетер еще на несколько миллиметров в вену. Зафиксируйте катетер, завязав швы по обе стороны от места введения.

Затем подсоедините один из катетеров к шприцу или шприцевому насосу для введения дополнительных доз анестетиков, таких как пентобарбитал натрия или кетамин-ксилазин. Повторите процедуру для другой вены и подсоедините второй катетер к шприцевому насосу для медленной внутривенной инфузии 4% раствора глюкозы, содержащего 1% бикарбоната натрия и 14% плазмона. В завершение зашейте кожу на шее с помощью иглы и шовного материала.

После этого верните мышь в положение на животе. Теперь сделайте разрез от верхней части бедра до ахиллова сухожилия. Отделите кожу от подлежащих мышц, стараясь не повредить кровеносные сосуды.

Затем определите передний край двуглавой мышцы бедра, который выглядит как белая линия, идущая вниз по бедру. После этого аккуратно сделайте разрез вдоль этой линии от колена до тазовой кости. Раздвиньте мышцы, чтобы обнажить седалищный нерв, расположенный под двуглавой мышцей бедра.

Осторожно препарируйте и удалите двуглавую мышцу бедра (m. biceps femoris). Чтобы обнажить седалищный нерв и мышцы трехглавой мышцы голени, найдите большеберцовый нерв, расположенный между общим малоберцовым и икроножным нервами. Среди различных ветвей большеберцового нерва выделите ветви, иннервирующие трехглавую мышцу голени, от ветвей, идущих глубже.

Используя восемь шелковых нитей OTT, перевяжите все ветви большеберцового нерва, оставив нетронутыми ветви, иннервирующие m. triceps surae. Перережьте большеберцовый нерв как можно дальше от узла. Определите позвонки T 13 и L 1, при этом T 13 является последним позвонком, к которому прикреплены ребра.

Затем иммобилизируйте позвоночный столб с помощью зажимов Каннингема на уровне T 13 и L 1 с обеих сторон. Будьте осторожны, чтобы не сдавить спинной мозг, но создайте небольшое натяжение по продольной оси. Убедитесь, что позвоночный столб надежно зафиксирован, осторожно прижав его пинцетом.

С помощью тонких ножниц для микрохирургии удалите остистые отростки и дуги позвонков T13 и L1, чтобы обнажить спинной мозг. Затем установите специально изготовленную пластиковую ванночку вокруг спинного мозга. После этого зафиксируйте ванночку на месте, используя шелковую нить размера 4-0.

Наконец, убедитесь в водонепроницаемости ванночки, загерметизировав её быстрозастывающим герметиком. После высыхания герметика удалите ватный тампон, прикрывавший спинной мозг, и заполните ванночку минеральным маслом. Используйте еще один вертебральный зажим, чтобы зафиксировать остистый отросток в области крестца.

Чтобы зафиксировать спинную область животного, используйте третий зажим для иммобилизации правой задней конечности и лодыжки в согнутом положении под углом 90 градусов в коленном и голеностопном суставах. Удалите марлю, покрывающую область задней конечности. Препарируйте ахиллово сухожилие, отделив его от окружающих тканей.

Максимально аккуратно отделите трехглавую мышцу от окружающих тканей с помощью иглы с затупленным концом. Пропустите шелковый шовный материал размера 0 через ахиллово сухожилие и завяжите вокруг него тройной узел. Затем расположите датчик силы вблизи узла.

После этого прикрепите сухожилие к датчику силы с помощью шелковой нити и отсеките дистальную часть сухожилия. Затем введите две проволоки из нержавеющей стали под фасцию мышц трехглавой голени. Эти проволоки подключаются к внеклеточному AC-усилителю.

Для регистрации ЭМГ поместите тройничной икроножной нерв на катод крючкового электрода, при этом анод должен касаться прилегающей мышцы. Затем стимулируйте тройничной икроножной нерв прямоугольными импульсами длительностью 50 microsecond с постепенным увеличением интенсивности при низкой частоте до достижения максимальной амплитуды сокращения. Затем стимулируйте тройничной икроножной нерв прямоугольными импульсами длительностью 50 microsecond с постепенным увеличением интенсивности при низкой частоте до достижения максимальной амплитуды сокращения.

На этих рисунках показано, как идентифицировать мотонейрон из группы трехглавой мышцы плеча. После проникновения при низкой интенсивности стимуляции при более высокой интенсивности может наблюдаться только моносинаптический ВПСП. ВПСП может быть достаточно большим, чтобы вызвать ортодромальный спайк при еще более высокой интенсивности стимуляции, действуя по принципу «все или ничего».

Антидромный спайк возникает с меньшим латентным периодом, чем моносинаптический ВПСП. Если через микроэлектрод подать ток достаточной силы для инициации спайка, то в мышце после короткой задержки можно будет зарегистрировать ЭМГ-активность, за которой последует мышечное сокращение.

После идентификации двигательного нейрона можно охарактеризовать его электрофизиологические свойства. Например, на данном рисунке показано, как измерить входное сопротивление с помощью гиперполяризующих и деполяризующих импульсов тока, построив график зависимости изменений мембранного потенциала от величины вводимого тока. Сократительные свойства двигательной единицы также могут быть изучены с использованием различных протоколов стимуляции.

Например, зависимость силы от частоты можно получить путем подачи коротких импульсов тока с различной частотой в мотонейрон. Затем значение установившейся силы может быть отнесено к частоте импульсов тока для построения сигмоидальной кривой зависимости силы от частоты. После освоения хирургической техники часть данной процедуры при идеальном исполнении может быть выполнена за три часа.