Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

Общая цель этой процедуры заключается в измерении ЭЭГ сна и концентрации лактата во время оптогенетической стимуляции в точных стереотаксических координатах. Хирургическим путем имплантируются необходимые электроэнцефалографические провода и канюли для датчика лактата и оптоволоконного кабеля. Затем вставьте оптоволоконный кабель и предварительно откалиброванный датчик лактата в их направляющие канюли в черепе животного.

Затем отрегулируйте интенсивность стимула синим светом для достижения желаемой электрофизиологической реакции. Затем приступайте к сбору электроэнцефалографических, электромиографических данных и данных о концентрации лактата, в то время как животному разрешается спонтанно вести себя и/или спать. По сравнению с другими методами, такими как фармакологические исследования ЭЭГ, этот экспериментальный подход имеет преимущество в мониторинге биохимии мозга и электрофизиологии, в то время как активностью нейронов манипулируют в режиме реального времени с точностью до секунды.

Таким образом, потенциал для получения новых идей в области исследований сна высок. Например, можно определить метаболические и электрофизиологические сопутствующие медленному сну. Этот тип эксперимента также может быть применен в других областях нейробиологии, таких как обучение и память, синаптическая пластичность или судорожные расстройства.

Хирургическая техника является технически сложной. Это требует большой ловкости, но этого можно достичь с помощью практики. В этой визуальной демонстрации я повторю критические шаги некоторых сложных хирургических процедур, которые дополнят письменное описание.

После того, как животное восстановилось после операции, задача состоит в том, чтобы правильно вставить датчик лактата и оптоволоконный кабель. Мы с Джонатаном покажем, как твердой рукой удерживать животное, чтобы вставить эти два хрупких элемента оборудования. Наконец, мы покажем, как оптимизировать реакцию ЭЭГ, регулируя интенсивность стимула в режиме реального времени.

Для этого эксперимента использовали трансгенных мышей, которые экспрессируют чувствительный к синему свету катионный канал. Канал принимает по два в корковых нейронах головного мозга. Сначала обезболите мышь, используя 5% изофтора, 95% кислорода для индукции, поддерживая анестезию с 3% изофтора, 97% кислорода.

Сделайте медиальный разрез на верхней части черепа от промежутка глаз до задней части черепа. Очистите череп перекисью водорода и стерильным физиологическим раствором. Найдите и пометьте B и Lambda для определения стереотаксических координат для конфигураций оптогенетических стимулов электродов, заправьте отверстия для винтов с помощью высокоскоростной стоматологической бормашины с шариковым наконечником диаметром 0,5 миллиметра, за которым следует шаровое сверло диаметром 0,7 миллиметра.

Вставьте электрод келограммовыми винтами в отверстия с помощью шлицевой ручной отвертки. Приводите их в движение примерно за четыре-пять оборотов, чтобы получить желаемую глубину. Удерживайте направляющие канюли на месте с помощью стереотаксической канюли, а затем прикрепите их к черепу и анкерам с помощью акрилового цемента Для сохранения проходимости каждая направляющая канюля должна содержать фиктивную канюлю или стилет с момента операции до момента эксперимента.

После того, как ЭЭГ и направляющие канюли расположены в черепе, соедините их вместе тонким слоем стоматологического акрилового цемента. После того, как цемент схватится, расположите пластиковый соединитель над высушенной цементной насыпью, продаваемой на концах проводов, исходящих от ЭЭГ, к контактам на пластиковом разъеме в случае, если провод ведет в цемент. Затем проведите провода электромиограммы через мышцы ядра, вставив их в цилиндр иглы 21 калибра.

Пронзенный через мышечную узел двойной хирургический узел, нейлоновый шов с пятью нулями вокруг этих проводов дистальнее того места, где они выходят из мышечного шва, обратно скрепляет кожу, которая была втянута для доступа к мышечной ткани с помощью одиночных прерывистых хирургических узлов с использованием обратного разреза P три иглы и пять швов нулевого нейлона. После того, как блок MC запрограммирован, запустите его как автономный генератор сигналов в качестве пятивольтового двоичного сигнала включения-выключения. Подключите блок стимула mc к блоку питания лазера с поддержкой TTL с разъемами BNC.

Подключите блок питания лазера к лазеру с помощью ленточного кабеля. Также подключите лазер к штекерному разъему FC на исходном оптоволоконном патч-кабеле. Подключите исходящий оптоволоконный кабель к вращающемуся соединению.

Коллектор Волоконно-оптический вращающийся шарнир служит коллектором. Когда животное перемещается по клетке, вращающийся шарнир вращается, чтобы предотвратить обрыв оптоволоконных кабелей из-за вращательного момента. С помощью пластиковых кабельных стяжек прикрепляют коллектор к металлической подставке, размещенной над цилиндрической клеткой, в которой содержится животное.

Ограничьте мышь, прижав мышь одной рукой к ладони. Расположите голову между средним и указательным пальцем экспериментатора. Теперь очистите направляющую канюлю от мусора, мусора с помощью стерильной иглы 25 калибра.

Затем вставьте оптоволоконный кабель вручную и закрепите его на канюле для оптоволоконной направляющей с помощью резьбовой винтовой крышки. Контролируйте глубину введения оптоволоконного кабеля в головной мозг с помощью шовного узла, завязанного на оптоволоконном кабеле на фиксированном расстоянии от плоского расщепленного конца. Датчик приравнивают к фосфатно-солевому буферу и подвергают воздействию трех концентраций L-лактата ступенчато.

В соответствии с протоколами производителя, вставьте предварительно откалиброванный датчик в канюлю с лактатным проводником, установленную в черепе, способом, идентичным процедуре введения оптоволоконного кабеля. Подключите датчик лактата к предусилителю биосенсора Pinnacle 8, 400 с биполярными штекерными разъемами. Затем прикрепите этот предусилитель к восьмиконтактному разъему на хирургически имплантированном креплении головки.

Перед сбором данных используйте ручку контроля интенсивности лазера для регулировки интенсивности оптогенетического стимула. Амплитуда ответа ЭЭГ будет варьироваться у разных животных из-за факторов, которые не изучались систематически. Поэтому необходимо регулировать интенсивность оптогенетического стимула и проверять, является ли ответ ЭЭГ адекватным.

Собирайте данные с помощью системы Pinnacle 8, 400 с нейрошкалой. Интерфейс SEIA классифицирует состояния сна путем визуального контроля процесса обработки данных ЭЭГ и ЭМГ. Данные в десятисекундных эпохах в виде пробуждения небыстрым движением глаз, сна или сна с быстрым движением глаз на основе ЭЭГ и ЭМГ.

Эта конфигурация оптогенетического стимула биосенсора показывает хирургически имплантированные электроды ЭЭГ, датчик лактата и канюлю для оптогенетической стимуляции. В отсутствие оптогенетической стимуляции у этой мыши возник спонтанный сон. Непрерывно контролировались переходы в состояние бодрствования при E-E-G-E-M-G и концентрации лактата в мозге, бодрствование и два подтипа сна.

Быстрое и небыстрое движение глаз определяются на основе ЭЭГ и ЭМГ. Интересно, что ток лактатного биосенсора увеличивается в зависимости от низкоамплитудной ЭЭГ и падает в зависимости от высокоамплитудной ЭЭГ. Оба канала ЭЭГ реагируют на оптогенетические стимулы, доставляемые в лобную кору.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как хирургически имплантировать мышь для одновременной оптогенетической манипуляции и измерения электроэнцефалограммы, электромиограммы и концентрации лактата в мозге. После освоения этой хирургической техники ее можно правильно выполнить за 90-120 минут. Не забывайте постоянно следить за дыханием животного в качестве мерилизатора глубины анестезии.

Если животное дышит реже, чем раз в четыре-пять секунд, анестезия может быть слишком глубокой. Если животное дышит чаще, чем раз в две секунды, анестезия может быть слишком легкой. Не забывайте соблюдать соответствующие меры предосторожности при использовании газоанестетика фтора.

Обеспечьте достаточную вентиляцию в операционном блоке, чтобы защитить сетчатку от лазера, используемого для оптогенетической стимуляции. Наденьте защитные очки или закройте животное в светонепроницаемом шкафу. Вы захотите попрактиковаться в имплантации биосенсора лактата и оптоволоконного кабеля в полностью бодрствующую мышь.

Мыши не соблюдают эти процедуры и должны быть обездвижены. Тем не менее, ограничение не может быть настолько сильным, чтобы травмировать животное или препятствовать дыханию.