Быстрая и эффективная генерация нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных в Multititre Формат плиты

Общая цель следующего эксперимента заключается в дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток человека или H-ПСК в нейроны с использованием формата мультититровых пластин. Это достигается путем сбора и осаждения одноклеточной суспензии H PSCs в V-образное дно 96. Хорошо прокладывайте планшеты для формирования тел эмбриона или EBS на ночь.

Затем ЭБС переводятся в U-образные пластины со сверхнизким уровнем прикрепления, содержащие среду для дифференцировки для индуцирования формирования нейроэктодермы. Впоследствии EBS наносятся на посуду с покрытием из матрицы, чтобы способствовать росту нейронов. Можно получить результаты, которые показывают наличие типичных нейрональных маркеров примерно на восьмой день с помощью иммунофлюоресценции.

Протоколы окрашивания для дифференцировки препотенциальных стволовых клеток человека в нейроны часто сложны и утомительны. Несколько случайно. Мы наткнулись на очень простую процедуру создания нейронов из препотентных стволовых клеток человека.

С технической точки зрения, основное преимущество этой методики из существующих методов заключается в том, что она проста в выполнении, быстра и экономически эффективна. В то же время процедуру будет представлять доктор MI Z из лаборатории. Подготовьте среду для формирования БЭ и среду для дифференцировки, как указано в письменном протоколе.

Выращивайте ПСК в условиях, не содержащих питатель, таких как кондиционированная метамфетамином среда на пластинах, покрытых матригелем, или с использованием химически определенных систем культивирования в условиях субсливающегося активного выращивания. С помощью стереомикроскопа со стерильным пластиковым наконечником для пипетки механически удаляются спонтанно дифференцированные колонии. Промойте оставшиеся недифференцированные колонии PBS и используйте Аккутан, содержащий один ингибитор породы, для расщепления до отдельных клеток.

Гранулируйте одиночные клетки центрифугированием при 200 G в течение двух минут и суспендируйте в небольшом объеме среду для образования ЭБ. Используйте гемоцитометр для определения титра клеток. Добавьте дополнительные клетки к оставшейся среде для образования БЭ, чтобы получить титр от 40 000 до 80 000 клеток на миллилитр.

С помощью многоканальной пипетки можно передать 100 микролитров на лунку на нижнюю пластину 96 В, в результате чего получается от 4 000 до 8 000 ячеек. Колодец. Вращайте планшет в центрифуге с качающейся пластиной при 400 G в течение одной минуты, чтобы собрать все ячейки на дне лунок. Перенесите клетки в инкубатор и дайте ЭБС сформироваться в течение ночи на следующий день под стереомикроскопом.

Соберите EBS и переложите в небольшом объеме в 3,5-сантиметровую бактериальную чашку, содержащую два миллилитра дифференцировки. Терпимая. Вымойте ячейки, аккуратно вращая посуду. Добавьте по 100 микролитров дифференцировочной среды в каждую лунку сверхнизкой насадки.

Дно 96 луночной пластины под стереомикроскопом. Перелейте EBS в небольших объемах из посуды для мытья в лунки 96 U. Инкубируйте EBS в течение четырех дней, чтобы обеспечить формирование нейроэктодермы на четвертый день.

Промойте клетки в среде для дифференцировки и засейте их одну за другой в лунки многотитровой пластины, покрытой матригелем, например, 12-луночной пластины. Клетки должны быть равномерно распределены внутри лунок, чтобы обеспечить беспрепятственный рост нейронов. Дайте EBS свободно прикрепиться к матригелю в течение примерно 10 минут при комнатной температуре.

Затем аккуратно перенесите пластину в инкубатор. Нейроны будут расти из пластинчатой EBS радиальным образом в течение следующих четырех дней. Ранее мы показали, что, как и многие другие, EBS из H PSC может быть получена путем простого повторного покрытия, агрегатов при регулярном разделении H-HPC на тарелки с низким уровнем прикрепления.

Обычно это приводит к широкому распределению размеров клеток. Другая проблема заключается в том, что ЭБС, поддерживаемые во взвешенном состоянии, имеют тенденцию агрегироваться друг с другом, что приводит к еще более высокой гетерогенности размеров для обхода этого единственного H-ПСК в лунках с низким уровнем прикрепления, что приводит к отсутствию образования БЭ и гибели клеток. Тем не менее, сочетание молекулы выживания клетки, Y 2 7 6 3 2 с поливиниловым спиртом, который, как было показано, усиливает образование EB из HSC, позволило образовать EBS из суспензий HESC одной клетки за ночь.

Удобно то, что размеры EB в этом формате многотитровых планшетов можно строго контролировать, устанавливая разное количество ячеек в лунку. В отличие от использования традиционных методов, после переноса ЭБС на пластины со сверхнизким прикреплением 96 U, формирование нейроэктодермы индуцировали с помощью низкомолекулярного коктейля, состоящего из ингибиторов F-G-F-E-R-K-T-G, бета-СМА ТГА два и АБ СМА один, что затем позволило нанести клетки на матригел для образования нейронов. Инициирование формирования БЭ примерно из 8000 клеток дало наилучшую способность к дифференцировке нейронов, которая характеризуется выраженными нейрональными выростами из пластинчатых БЭ.

Снижение некротических центров БЭ после пластинирования и высокая экспрессия сенсорных и паннейрональных маркеров, таких как B rrn три A и бета три тубулина. Общая эффективность дифференцировки нейронов, по-видимому, сопоставима с оригинальной процедурой, которая до сих пор применима как к ГСК, так и к ПСК ГИ. Три независимые линии HPSC, HES и HIPS cells были успешно протестированы в многолуночной процедуре, в то время как вариабельность и эффективность дифференцировки, зависящие от клеточной линии, в целом не могут быть исключены.

На этом рисунке показаны диссоциированные нейроэктодермальные клетки за один день, которые были выделены в виде одиночных клеток и успешно дифференцировались с эффективностью около 60%.