Ортотопической трансплантации аорты у мышей для изучения сосудистых заболеваний

Целью данной процедуры является трансплантация брюшной аорты мыши-донора аллогенной мыши-реципиента. Сначала извлекается аорта донора, после чего у животного-реципиента подготавливается место имплантации трансплантата.

Затем нативную аорту животного-реципиента препарируют и разделяют. Заключительным этапом является выполнение двух конце-в-конец сосудистых анастомозов для имплантации донорской аорты. В конечном итоге данная процедура может быть использована для изучения развития посттрансплантационных сосудистых заболеваний при использовании аллогенных комбинаций линий.

Преимуществом данного метода по сравнению, например, с гетеротопической трансплантацией сердца является упрощение морфометрического анализа благодаря однородному размеру сосудов. Кроме того, сосуд не окружен паренхиматозной тканью, в которой могут присутствовать клеточные инфильтраты и другие элементы, способные осложнить анализ полученных данных. Использование этой методики может быть особенно полезным для иллюстрации механизмов развития пострансплантационной васкулопатии, которая представляет собой трудноразрешимую проблему в клинической практике трансплантации у людей.

Чтобы минимизировать воздействие стресса и максимально увеличить энергетические резервы животных, содержите их в виварии не менее 72 часов до операции. В день операции поместите металлический операционный стол на грелку, настроенную на температуру от 35 до 38 градусов Цельсия. Затем, после проведения анестезии, удалите шерсть с вентральной поверхности живота животного.

С помощью лабораторной ленты зафиксируйте животное на операционном столе в расправленном положении, затем трижды обработайте всю выбритую область антисептиком и этанолом, используя стерильные ножницы. Затем сделайте разрез через брюшную стенку, чтобы обнажить органы брюшной полости. После этого с помощью стерильного ватного тампона отодвиньте внутренние органы в сторону на кусок стерильной марли, смоченной теплым физиологическим раствором, чтобы открыть доступ к крупным сосудам брюшной полости.

Теперь очень осторожно тупо отдепите брюшную аорту от окружающих тканей, включая нижнюю полою вену, затем аккуратно приподнимите и прижгите поясничную артерию. Участок аорты для диссекции должен находиться ниже почечных сосудов и выше бифуркации аорты на бедренные артерии. После определения области наложите одну лигатуру чуть ниже почечных артерий и другую — чуть выше бифуркации.

Затем с помощью ножниц рассеките аорту, после чего очень осторожно зажмите один конец сосуда и капайте гепаринизированный физраствор так, чтобы он протекал через сосуд под действием силы тяжести. Далее, максимально ограничив манипуляции с концами сосуда, извлеките трансплантат и немедленно поместите его в контейнер с ледяным физраствором.

После введения реципиенту животному анестетика и анальгетика выбрейте шерсть на вентральной поверхности живота, как показано на видео. Нанесите на глаза гентамициновую глазную мазь для предотвращения их пересыхания, затем продезинфицируйте живот, как было продемонстрировано, чтобы обеспечить надлежащую антисептическую обработку. Теперь выполните по срединной линии разрез кожи и брюшной стенки поэтапно.

Затем вставьте расширитель, чтобы зафиксировать разрез брюшной полости в открытом состоянии, направив винтовой механизм к задней части животного, чтобы основная часть зажима не мешала работе. Затем наложите на кишечник стерильную марлю, смоченную в физиологическом растворе. После этого осторожно придержите марлю пальцем.

Вставьте стерильный хлопковый тампон под кишечник и осторожно отодвиньте его так, чтобы кишечник оказался поверх марли. Положите на кишечник еще один кусочек стерильной марли и смочите его физиологическим раствором. Аккуратно удалив жировую ткань, покрывающую ATA и нижнюю полую вену, с помощью пинцета осторожно отделите подпочечную аорту от нижней полой вены.

Теперь освободите область, достаточно большую, чтобы разместить два зажима, и обеспечьте достаточную длину сосуда, чтобы после разделения осталась часть сосуда, к которой можно будет пришить трансплантат. Обратите внимание, что черную шовную нить можно использовать для контроля натяжения вдоль сосуда. При диссекции следите за ответвлениями сосудов, при необходимости коагулируя их коагулятором при низкой температуре.

Затем установите один сосудистый зажим чуть ниже почечной артерии, а другой — чуть выше бифуркации. После этого пересеките аорту. В данном случае разрез сделан ближе к бифуркации, так как одна из ветвей была коагулирована примерно посередине между двумя зажимами, что делает этот участок неподходящим для проведения анастомоза; концы аорты обычно сокращаются, оставляя промежуток около пяти миллиметров.

Проверьте гемостаз. Если зажимы установлены правильно, после разреза должно выделиться лишь небольшое количество крови. Затем промойте разрезанные концы аорты гепаринизированным физиологическим раствором и удалите излишки раствора ватным тампоном.

Теперь зафиксируйте трансплантат в нужном положении, наложив по три прерывистых шва на каждом конце. Затем наложите по одному шву с каждой стороны анастомоза на обоих концах и заполните оставшиеся промежутки семью-восьмью прерывистыми швами. Если предпочтительнее использовать непрерывный шов, следите за тем, чтобы стенки сосудов оставались расслабленными и не возник стеноз в области анастомоза.

Теперь осторожно снимите зажим с краниального конца аорты и проверьте наличие утечек по линиям швов. Затем, аккуратно нажимая на аорту выше места анастомоза смоченным ватным тампоном, снимите второй зажим. Слегка сожмите и отпустите аорту несколько раз, чтобы убедиться в проходимости сосуда. Перфузия трансплантата начнется немедленно, и должна появиться видимая пульсация.

Теперь удалите марлю, покрывающую кишечник, и верните его на место, сохраняя нормальную анатомическую ориентацию и избегая перекручивания. Используйте шовный материал Vicryl 5-0 для закрытия мышечного слоя, а затем зашейте кожу нитью Prolene 5-0 или 6-0. Перед прекращением анестезии введите мыши карпрофен подкожно для усиления анальгезии, после чего введите мыши 0,5–0,8 мл физиологического раствора тем же путем.

Наконец, поместите мышь в подогреваемую клетку для восстановления и внимательно наблюдайте за животным. Через 12 и 24 часа после операции подкожно введите животному бупренорфин и карпрофен соответственно. На этом первом рисунке показан аортальный трансплантат.

Обратите внимание на линии швов, отмеченные здесь белыми стрелками. Представлен типичный эксперимент, в котором выживаемость реципиентов отслеживалась в течение 56 дней. Контрольная группа состояла из реципиентов — мышей дикого типа C 57 BL six by FVB, которым были трансплантированы аорты из кишечника C.

Экспериментальная группа состояла из реципиентов C 57 BL six x FVB с дефицитом экспрессии гемаксигеназы-1. Данный нокаут приводит к тромбозу трансплантатов в течение 24 часов. Примечательно, что это привело к гибели всех реципиентов.

На этом последнем рисунке представлены результаты эхо-измерений нижней полой вены, полой вены и брюшной аорты у здорового животного и у реципиента трансплантата. Обратите внимание, что трансплантат проходим и по виду схож с аортой животного, не подвергавшегося трансплантации. Как вы заметили, ткани очень хрупкие и маленькие, поэтому следует иметь в виду, что данная процедура требует определенного навыка; следовательно, потребуется значительная практика, прежде чем процедура сможет выполняться успешно и рутинно после ее освоения.

При правильном выполнении эта методика может быть реализована в течение одного часа.