Вскрытие и иммуногистохимического личинок, куколок и взрослых Drosophila Сетчатки

Общая цель этой процедуры заключается в получении оптимальных диссекций сетчатки дрозофил и визуализации белков, экспрессируемых в развивающейся сетчатке. Во-первых, расслоение сетчатки демонстрируется на трех стадиях развития: личиночной стадии, зрачковой стадии и взрослой стадии. Следующими этапами являются фиксация и иммуногистохимия.

На заключительном этапе сетчатка монтируется на предметные стекла для визуализации с помощью конфокальной микроскопии. В конечном счете, этот протокол показывает развитие и дифференцировку клеток сетчатки на уровне отдельных клеток. Исторически сложилось так, что сетчатка мухи была идеальной системой для решения широкого круга вопросов биологии развития и изучения лежащих в ее основе генетических регуляторных механизмов.

Здесь мы покажем вам техники визуализации развивающихся клеток сетчатки от плюрипотентной стадии до терминально дифференцированного состояния, я покажу вам, как препарировать лаву или сетчатку. Я продемонстрирую вскрытие на сетчатке среднего зрачка, поскольку ядра фоторецепторов находятся почти в одной фокальной плоскости. Этот этап идеально подходит для сравнения экспрессии ядерных локализованных белков, таких как факторы транскрипции.

Сегодня я покажу вам, как препарировать сетчатку глаза взрослой мухи. Чтобы облегчить воспроизводимое стадирование фаз развития, в этих условиях дрозофилы должны содержаться при постоянной температуре 25 градусов Цельсия и в течение светлого темнового цикла 1212 градусов. Личинки третьего возраста будут доступны примерно через 96 часов после регуляции, когда личинки позднего третьего возраста покидают пищу, чтобы поесть.

Их можно удалить с помощью мягкой щетки или щипцов. Собрав личинок, поместите их в каплю холодной PBS на тарелку для вскрытия силгарда. Приготовьтесь к рассечению от 10 до 15 сетчаток в каждой экспериментальной группе.

Под микроскопом для препарирования найдите передний конец лавы, в котором находятся крючки для рта. С помощью щипцов осторожно прижмите среднюю часть лавы к основанию чаши для защиты сила. С помощью других щипцов возьмитесь за крючки для рта и осторожно и медленно потяните от тела.

Отбросьте основную часть тела, а затем используйте ротовые части для удержания передней части. Цель здесь состоит в том, чтобы удалить посторонние ткани из имагинального, дискового и мозгового отделов. Теперь возьмитесь за крючки для рта щипцами и перенесите мозг с помощью имагинальных дисков в стеклянную тарелку трех миров, наполненную PBS.

Далее замените ПБС на свежеприготовленный фиксатор и выдержите ткань на шейкере в течение 15 минут комнатной температуры. Через 15 минут снимите фиксатор с помощью пипетки P 200. Дважды промойте ткань PBS и переложите в свежую ванну PBS.

Постирайте салфетку на шейкере при комнатной температуре в течение 30 минут. Теперь извлеките PBS и дважды прополощите салфетки PBST. Затем добавьте обратно свежий PBST и приготовьтесь к дальнейшему препарированию ткани под микроскопом.

Удалите слюнные железы и жировую ткань. Затем отделите имагинальный диск глаза от остальной ткани. В настоящее время он готов к иммуногистохимической обработке.

После обработки тканей перенесите их в центр чистого предметного стекла. С помощью пипетки P 20 удалите излишки раствора, а затем с помощью щипцов выровняйте сетчатку по центру предметного стекла. Для визуализации.

Теперь нанесите на сетчатку 10 микролитров монтажной среды. Аккуратно накройте их чехлом и прикрепите слип к слайду прозрачным лаком для ногтей. Температура 25 градусов по Цельсию и 50% будет наблюдаться примерно через 48 часов после окукливания.

Их лучше всего приурочивать к кружению, только что сформировавшемуся белому или 0% пубе на флаконе или просто перемещая их в новую пробирку. Через 48 часов среднюю куколку можно аккуратно удалить с помощью щипцов и перенести в PBS Под микроскопом захватите щипцами задний конец зрачкового корпуса. Далее захватите переднюю поверхность кутикулы другими щипцами и аккуратно удалите оперкулум.

Снимите остатки кутикулы, чтобы полностью обнажить головку. Теперь с помощью кончиков щипцов проткните лежащий под ним мягкий мешок в тыльной передней области. Это обеспечивает доступ к голове.

Аккуратно отделите головку от грудной клетки, медленно всасывая головку с помощью пипетки P 20, вытолкните головку из пипетки в свежий PBS. Сетчатка, прикрепленная к мозгу, будет свободно плавать. Дополнительная капля PBS может помочь в обнаружении прозрачной сетчатки.

Как только ткани осядут, удалите лишнюю ткань, включая головную кутикулу и бобо. Перенесите сетчатку и мозг в новую PBS, при этом вся сетчатка и мозг изолированы в PBS. Замените раствор свежеприготовленным фиксатором.

Затем выдержите ткань на шейкере в течение 15 минут при комнатной температуре. Через 15 минут извлеките фиксатор с помощью пипетки и трижды прополощите ткань. С помощью PBST дайте тканям оставаться омытыми PBST и подготовьтесь к дальнейшему рассечению.

Это самый сложный этап протокола. Удалите пластинку и мозг, предварительно изучив ткани. Проткните лепесток зрительного нерва с помощью очень острой рассекающей иглы.

Затем вставьте столь же острую рассекающую иглу между пластинкой и сетчаткой, чтобы отделить сетчатку от пластинки и зрительной доли. Сетчатка теперь может быть окрашена, однако будьте очень осторожны при обращении с ней, так как она очень хрупкая и липкая. После окрашивания ткани закрепите сетчатку среднего зрачка с помощью пипетки P 20, чтобы перенести ее в центр чистого, положительно заряженного предметного стекла.

Удалите излишки PBST, а затем с помощью игл выровняйте сетчатку для визуализации. Теперь нанесите на сетчатку 10 микролитров монтажной среды. Используя салфетку и капиллярное воздействие, удалите PBST после аккуратного наложения защитного стекла.

Предметное стекло готово к визуализации. Начните со сбора голов двух-пятидневных мух в стеклянную дикую посуду, содержащую холодный XPBS. Перенесите одну голову в каплю холодной PBS на S-чашке.

Начните диссекцию с захвата передней капсулы головки щипцами, а затем удалите ротовые части. Далее захватите вентральную заднюю кутикулу головки одним щипцом и другим отделите один глаз от кутикулы, разрывая по ее краю. Приступайте к удалению кутикулы по краю глаза для последующих манипуляций.

Удобно оставлять небольшой кусочек кутикулы прикрепленным к сетчатке. Теперь перенесите сетчатку в стеклянную дикую чашку, содержащую холодную PBS, с помощью щипцов, когда все сетчатки будут рассечены. Замените PBS на свежеприготовленный фиксатор.

Убедитесь, что внутренняя часть сетчатки соприкасается с фиксатором. Даже если сетчатка плавает на поверхности, инкубируйте ткань на шейкере в течение 15 минут при комнатной температуре Через 15 минут снимите фиксатор с помощью пипетки P 200 и дважды промойте ткань PBS. Затем постирайте салфетку в течение 30 минут или дольше на шейкере при комнатной температуре.

Теперь удалите PBS, добавьте PBST и приготовьтесь удалить пластинки. Часто пластинка остается прикрепленной к внутренней поверхности рассеченной сетчатки. Удалите его, захватив щипцами сетчатку с одного края и осторожно оттянув пластинку другими щипцами.

Затем удалите оставшуюся кутикулу, чтобы она не сворачивалась на сетчатку. Во время монтажа ткани пластинки и кутикулы в противном случае будут мешать визуализации окрашенных фоторецепторов. Теперь сетчатка может быть окрашена.

Рассечение сетчатки глаза взрослого человека можно освоить с помощью нескольких недель практики. Излив и удаление пластинок, вероятно, самая сложная часть. Мой совет — наберитесь терпения и препарируйте гораздо больше информации, чем вы думаете, что вам понадобится.

Также полезно потренироваться с красноглазыми мухами, прежде чем пробовать с белоглазыми мухами. После окрашивания сетчатка должна быть ориентирована на предметное стекло моста для получения изображения. После закрепления лентой фонарь моста можно хранить при температуре четыре градуса Цельсия с помощью описанной процедуры.

Образцы сетчатки на трех стадиях развития подготавливаются к микроскопии. Диск имагина личинки глаза окрашивали антителами, которые обнаруживают два фактора транскрипции, экспрессирующихся в разных типах фоторецепторов. Белок семь вверх показан зеленым цветом, а белок коротышка показан пурпурным.Enter.

Изолированную сетчатку среднего зрачка инкубировали с антителами, которые визуализируют различные типы фоторецепторов. Красители против LLV синего цвета, которым помечены все фоторецепторы, и против просперо. В голубом цвете, который помечает R семью фоторецепторами.

Сетчатка взрослого человека была окрашена двумя красными каплями антител для визуализации двух подтипов фоторецепторов. Стохастическая и взаимоисключающая экспрессия RH 5 в голубом цвете и Rh 6 в красном цвете происходит в двух подтипах фоторецепторов R eight. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как препарировать зрачок личинок и сетчатку взрослого человека, а также как визуализировать клетки сетчатки с помощью иммуногистохимии.

В сочетании с доступными подходами к потере и приобретению функции, специфичным для глаза. Этот протокол позволит изучить генетические механизмы, лежащие в основе развития глаз. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.