Сотовые слежения Использование Photoconvertible белков в процессе развития данио рерио

Общая цель этой процедуры заключается в отслеживании фотопереключаемых клеток в живом эмбрионе рыбки данио. Это достигается путем предварительного встраивания эмбриона, экспрессирующего тканевую специфичную фотографию, конвертируемый флуоресцентный белок при низкой температуре плавления. Затем белок в пределах исследуемой области полностью фотопреобразуется.

Затем эмбрион осторожно извлекают из ароса и выдерживают в яичной воде при температуре 28,5 градусов Цельсия до более поздних стадий. Наконец, фотопреобразованный эмбрион снова погружается в низкую температуру плавления. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие, что фотоконвертированные клетки могут быть точно обнаружены на более поздних стадиях благодаря стабильному присутствию фотоконвертированного белка с помощью конфокальной микроскопии.

Поэтому мы думаем, что метод, который мы представим сегодня, будет весьма полезен в контексте клеточной биологии и биологии развития. Поэтому мы считаем, что использование этой методологии в контексте миграции клеток, динамики тканей и других видов поведения клеток будет весьма полезным. Демонстрировать процедуру будет Вероника Ломбардо, постдок из моей лаборатории «После скрещивания трансгенных рыбок данио, экспрессирующих фотоконвертируемый флуоресцентный белок».

Выберите самые яркие эмбрионы, которые являются гомозиготными, и выращивайте их при температуре 28,5 градусов Цельсия, когда они достигнут желаемой стадии. Используйте щипцы, чтобы покрыть их стеклянной емкостью с яичной водой, чтобы обезболить эмбрионы. С помощью стеклянной пипетки или отрезанного наконечника пипетки переведите их по одному в трику.

Перенесите обезболенный эмбрион на крышку чашки для культивирования и поддерживайте эмбрион в минимально возможном объеме среды. Перенесите эмбрион в арос, попробовав его пипеткой с низкой температурой плавления 1% с трикой при 30 градусах Цельсия, и поместите его в чашку для культуры с покровным стеклянным дном. Используйте гладкий пластиковый наконечник, чтобы сориентировать эмбрион, когда агрос полимеризуется.

Накройте его раствором Trica на инвертированном конфокальном микроскопе, оснащенном лазерными источниками 405, 488 и 561 нанометров и объективом с 20-кратным увеличением. Используйте лазеры 488 и 561 нанометров для создания Z-стека всей структуры образца, которая включает в себя интересующую область. Выберите инструмент временных рядов и установите два цикла без интервала, один для предварительного и один для преобразования пост-фото.

Выберите инструмент региона и определите одну или несколько областей интереса для преобразования фотографий. Далее выберите инструмент для отбеливания и установите начало отбеливания после сканирования. Одним из двух использованных здесь является 30-милливаттный 405-нанометровый диодный лазер.

Тщательно оптимизирован для минимального количества лазерного света, необходимого для полного преобразования фотографий, что достигается за счет изменения интенсивности лазерного света, итераций сканирования интересующей области и скорости сканирования. Отсканируйте образец с помощью лазеров с разрешением 488 и 561 нанометров, чтобы визуализировать оставшийся зеленый цвет и фотопреобразованную красную флуоресценцию фотоконвертируемого флуоресцентного белка. После фотоконверсии выбросьте раствор и с помощью иглы или гладкого пластикового наконечника аккуратно извлеките зародыш из агроса.

Выдержите эмбрион в яичной воде в темноте при температуре 28,5 градусов Цельсия до желаемой стадии развития. Вживите эмбрион во второй раз, затем сгенерируйте Зака образца, включая интересующую область, снова используя лазеры 488 и 561 нанометров. Поскольку этот протокол не влияет на нормальное развитие, можно наблюдать за фотопреобразованным эмбрионом на более поздних стадиях.

Вот пример конверсионного анализа фотографий. Эндотелиальные клетки отслеживались во время развития рыбок данио в период от 48 до 72 часов после оплодотворения с использованием трансгенной репортерной линии, экспрессирующей удар G в эндотелиальных ядрах, как показано здесь, до фотоконверсии: удар G экспрессировался в эндотелиальной ткани и был обнаружен только как зеленая флуоресценция с помощью контрольного сканирования аргоновым лазером 488 нанометров с лазером 561 нанометр для красной флуоресценции. Не обнаружил ни одного фотопреобразованного удара GR до преобразования фотографий.

Впоследствии область интереса была полностью преобразована с помощью диодного лазера с яркостью 405 нм с интенсивностью 10% в 20 итераций, а сосуды головы были снова отсканированы с помощью лазеров 488 нм и 561 нм. На этой панели зеленый удар G полностью переключился на красный в пределах интересующей области, чтобы отслеживать фотопреобразованные эндотелиальные клетки на более поздних стадиях. Эмбрион наблюдался через 24 часа после фотоконверсии, то есть примерно через 72 часа после оплодотворения в эндотелиальных тканях, возникающих из представляющей интерес области фотоконвертации.

Наблюдались как не, так и фотоконвертированные белки Kick G из-за стабильности красного флуоресцентного фотопреобразованного kick g и синтеза нового зеленого неконвертированного kick G после его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области биологии развития к изучению клеточной биологии и ремоделирования тканей у нескольких рыб.