Количественные измерения иммунного ответа и сна в Drosophila

Общая цель данного эксперимента — оценить сон и иммунную функцию дрозофилы. Во-первых, это достигается путем регистрации локомоторной активности инфицированных мух для измерения сна и выживаемости в качестве второго шага после того, как инфицированные мухи гомогенизируются, разбавляются и распространяются на пластины LB-агара. Количество растущих колониеобразующих единиц указывает на способность мух избавляться от инфекции.

Затем инфицированные мухи, экспрессирующие трансген, содержащий репортер NF kappa b luciferaza, добавляют в 96-луночный планшет, содержащий люцифериан, субстрат люциферазы. Измерение люциферазы каппа b в режиме реального времени указывает на активацию сигнального пути NF каппа B во время инфекции в целом по выживаемости во сне. Бактериальный клиренс и активность репортера NF KB являются измерениями, которые дают механистическое представление о молекулярной связи между иммунной функцией и поведением.

Как правило, люди плохо знакомы с этим методом или испытывают трудности, потому что требуется время и практика, чтобы научиться заражать мух вручную с постоянством. Основное преимущество метода «Люцифера» перед существующими методами, такими как QPCR, заключается в том, что активность NF Kappa B может быть измерена непрерывно в режиме реального времени в жизни. Мухи начинают с инкубации поздних стадийных культур дрозофил в течение трех-четырех дней, чтобы взрослые особи адаптировались к условиям окружающей среды.

Здесь мух помещают под постоянный свет, чтобы исключить влияние циркадных часов на иммунный ответ и поведение. Следующая загрузка от одного до четырех дней летит в активность. Мониторы регистрируют их активность в течение как минимум трех дней до заражения, за один день до запланированного заражения.

Выберите одну колонию SIA со стерильным наконечником для пипетки и погрузите наконечник в культуральную пробирку, содержащую пять миллилитров среды LB, чтобы проверить стерильную технику. Не забудьте сделать контрольный макет культуры без бактерий. Выращивайте бактерии в течение ночи, пока они не достигнут фазы экспоненциального роста на следующий день.

Измерьте абсорбцию культуры с точностью до 600 нанометров. Включите второго ветеринарного врача Q в качестве бланка. Он готов при концентрации от 0,5 до одной единицы абсорбции субкультуры или при необходимости продлевает время культивирования.

Теперь приготовьте бактериальный раствор для заражения мух. Разбавьте бактерии PBS до ожидаемой абсорбции 0,1 при 600 нанометрах. Затем добавьте пищевой краситель для контроля впрыска

Замените бактерии на среду LB. Храните оба раствора на льду. Далее с помощью микропипетки сделайте инъекционные иглы с тонким кончиком под рассекающим микроскопом.

Используйте тонкие щипцы, чтобы отломать кончик каждой иглы, чтобы отверстие было достаточно большим, чтобы его можно было заполнить инъекционной жидкостью с помощью отсасывания, но также достаточно маленьким, чтобы свести к минимуму повреждение мухи. С помощью шприца прикрепите стеклянную иглу к пластиковому шприцу объемом три куб. см с длиной трубки. Расход закачиваемой среды контролируется вручную.

Избегайте загрязнения резиновой трубки жидкостью для инъекций, так как шприцевой аппарат используется как для инфекционного, так и для контрольного введения. Проверьте расход инъекционной среды с помощью салфетки Кима. Двумя критически важными деталями для успешной инъекции являются использование иглы оптимального размера и надежное уплотнение между иглой и шприцем.

Как только система впрыска будет полностью готова, обезболите мух, используя минимальный поток углекислого газа, действуйте быстро, чтобы ни одна муха не находилась под наркозом дольше пяти минут. Теперь вводите мух, протыкая стеклянную иглу в область над перекошенным теллумом спинной грудной клетки. О прохождении инъекционной среды в муху свидетельствует пищевой краситель, который можно увидеть по мере растекания введенного раствора.

Прежде чем начать, убедитесь, что все материалы, используемые для этой процедуры, также были автоклавы как минимум за сутки. Приготовьте 10-сантиметровые чашки Петри с LV агаром средней. В день эксперимента обезболить и поместить мух в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров

Подготовьте минимум две группы по 10 мух в каждой для каждого экспериментального условия. Также подготовьте контрольную группу мух без заражения, особенно при использовании бактериального штамма без устойчивости к антибиотикам. Храните все загруженные трубки на льду.

Затем добавьте 400 микролитров среды LB в каждую пробирку, загруженную мухой. Гомогенизируйте мух с помощью небольшого колокольчика и делайте это рядом с пламенем, чтобы предотвратить заражение. Теперь с помощью разрезанных наконечников для пипетки серийно разбавляют гомогенат в 10 раз в объемах 200 микролитров.

Если гомогенат производится сразу после заражения сиа, вносят дилу до одного к 1000, но в течение 24 часов, после заражения гомогенат, вносят до одного к 100 000. Далее семена, самые крупные два дилу на 10-сантиметровых пластинах с помощью стеклянных шариков для обеспечения равномерного распределения, инкубируют пластины в течение ночи. На следующий день подсчитайте количество колоний на табличке с помощью прямого наблюдения или с помощью программного обеспечения для подсчета колоний.

Затем подсчитайте количество колониеобразующих единиц на одну муху. В этом анализе используются трансгенные мухи, несущие каппа b люциферазу в нужное время. Для анализа также требуются культивируемые бактерии, такие как SCIA, подготовленные для инъекций, как описано в предыдущем разделе.

Приспособьте мухи к экспериментальным условиям освещения. В этом примере мух каппа b люциферазы возрастом от одного до четырех дней помещают во флаконы, содержащие 5% сахарозы, 2%-ную пищевую среду, и помещают на постоянный свет в течение двух дней. Теперь подготовьте микропланшет 96 Well для мух.

Заполните каждую лунку двумя слоями корма. Сначала добавьте в среднюю по 300 микролитров 5%-ной сахарозы, 2%-го раствора агара. Хорошо накройте тарелку тканью с мелкой сеткой и дайте тарелке хорошенько высохнуть в течение часа.

Затем добавьте верхний слой объемом 50 микролитров в каждую лунку, содержащий 5% сахарозы, 1% агара и два миллимоляра Люцифера. Поскольку Люцифер чувствителен к свету, дайте пластине высохнуть в темноте и в будущем. Сведите к минимуму воздействие света на пластину.

Как только агар остынет, накройте тарелку прозрачной клеевой пленкой. Затем с помощью тонкой иглы дважды продырявите пленку над каждой лункой. Эти отверстия обеспечивают воздухообмен и газообразную анестезию.

Далее, чтобы облегчить нахлыстовую загрузку, используйте острое лезвие и прямую кромку, чтобы ввести разрез между каждым столбиком. Обезболите мух углекислым газом и загрузите их по одной в каждую скважину колонка за колонной. Если муха застряла в пленке, дайте ей возможность освободиться, прежде чем вмешаться.

Верните микролуночный планшет в инкубатор под постоянным светом на срок от восьми до 24 часов. Чтобы обезболить хорошо связанных мух, используйте наконечник микропипетки, прикрепленный к линии низкого давления углекислого газа. Убедитесь, что газ находится под безвредно низким давлением, и поместите наконечник микропипетки прямо над вентиляционными отверстиями, чтобы обезболить муху группами по восемь человек.

Перенесите каждую муху на площадку с CO2 и заразите их бактериями, как и раньше. Затем верните каждую муху в исходную лунку и снова запечатайте микропластину. Измерьте люминесценцию у каждой мухи с помощью люминометра, расположенного в помещении с регулируемой температурой и заданным графиком освещения.

Загрузите пластины в кассету для штабелирования, убедившись, что пластины с мухами сложены между прозрачными пустыми пластинами. Запрограммируйте люминометр в соответствии со спецификациями производителя и собирайте показания каждый час в течение как минимум 24 часов. В этом примере детекторы запрограммированы на считывание показаний каждой лунки в течение 10 секунд.

После завершения экспортируйте файлы данных в электронную таблицу и выполните стандартный анализ с отображением результатов в виде графиков. Данные примера могут быть проанализированы. Скидки в секунду усреднены от трех показаний на лунку.

Дикий вид Canton S летает и наслаждается. Мутантные мухи E 20, лишенные гена NF kappa B, были загружены в два монитора активности при постоянном освещении и заражены sia. В этом примере инфекция способствовала засыпанию.

Было ясно, что мутанты Relish E 20 спали меньше, чем контрольные мухи Canton после заражения. В соответствии с предыдущими выводами, мутанты Е 20 также быстро поддались инфекции по сравнению с мухами дикого типа.

Большинство мух выжили после инъекции асептического контроля, что указывает на то, что мухи погибли от инфекции, а не от травмы из-за инъекции. Поскольку мутанты умирали так быстро, только мухи Кантона использовались для демонстрации бактериальной нагрузки после заражения. Sia продолжала размножаться у мух через 24 часа после заражения.

Репортерская деятельность Люцифера показала большие различия между отдельными мухами и между успехом точек данных. Хотя сигнал поступает от всех тканей внутри мухи, не ожидается, что каждая ткань будет излучать одинаковое количество сигнала, и видимость ткани для детектора будет меняться по мере движения мухи. В этом примере мухи были инфицированы и сравнены с контрольной группой.

Погибшие мухи были исключены из анализа по всей группе мух. Активность репортеров Kappa b Luciferase неуклонно растет после заражения. Активность репортера Kappa b Luciferase также неуклонно росла после асептической травмы.

Пик активности составил около 12 часов как после травмы, так и после инфекции. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как количественно оценить иммунную функцию и сон при ССО после инфекции. Мы можем измерить сон, выживаемость, время, бактериальный клиренс и активность репортера в реальном времени.