По всему геному Гена удаления в

Общая цель данной процедуры заключается в осуществлении полногеномного делетирования одиночных генов у streptococcus sanguine с помощью высокопроизводительной ПЦР. Это достигается путем первоначального получения трех ампликонов посредством высокопроизводительной ПЦР-амплификации, включая ген устойчивости к антибиотикам, а также выше- и нижележащие последовательности ДНК целевого гена. На втором этапе получается линейный рекомбинантный ПЦР-ампликон, используя три ПЦР-ампликона в качестве матриц.

Затем подготавливают компетентные клетки s sanguine. Заключительным этапом является трансформация линейного рекомбинантного ПЦР-ампликона в компетентные клетки s sanguine. В итоге для проверки правильности мутаций используют ПЦР-амплификацию колоний и секвенирование ДНК.

Основным преимуществом данной методики перед другими исчерпанными методами, такими как нокаут с помощью суицидальных плазмид, является возможность создания делеционного мутанта в масштабе всего генома непосредственно с применением высокопроизводительного анализа. Праймеры для ПЦР могут быть сконструированы и синтезированы согласно описанному в письменном протоколе способу с использованием внутренних скриптов на основе последовательности генома streptococcus sanguineous SK 36. Были разработаны три набора праймеров для амплификации последовательности длиной 1 kb выше по течению от целевого гена, кодирующей области гена A PHA three ENC, белка устойчивости к канамицину и последовательности длиной 1 kb ниже по течению от целевого гена.

Ген-специфические праймеры. R1 и F3 разработаны на основе 5'- и 3'-последовательностей целевого гена для высокопроизводительной амплификации области размером 1 kb выше или ниже целевых генов s sanguine. Сначала приготовьте смесь для ПЦР в 15-мл конической пробирке на льду.

См. текст для определения компонентов смеси для ПЦР, содержащей геномную ДНК s sanguineous; перенесите 23 µL смеси в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета с помощью многоканального дозатора. Для амплификации вышележащей последовательности целевого гена перенесите по 1 µL праймеров F1 и R1 из рабочих планшетов с праймерами концентрацией 10 µM в ПЦР-планшет с помощью многоканального дозатора. Аналогично поступите с праймерами F3 и R3 для амплификации нижележащей последовательности целевого гена. Закройте ПЦР-планшет и проведите амплификацию при 94 °C в течение 1 минуты, затем выполните 30 циклов при 94 °C в течение 30 секунд.

54 °C в течение 30 секунд и 68 °C в течение 1,5 минут. После амплификации приготовьте 1% agarose gel, содержащий подходящий бромид, с 48 лунками, подходящими для загрузки многоканальным дозатором. Смешайте 4 µL продукта ПЦР с 1 µL 5X DNA loading buffer.

На планшет с 96 лунками внесите образцы в агарозный гель с помощью 10 µL многоканального дозатора. Проведите электрофорез при 135 вольтах в течение 30 минут. Проанализируйте полосы на геле с помощью системы визуализации и анализа UVP.

Очистите продукты ПЦР с помощью набора Pure Link 96 PCR Purification Kit методом центрифугирования согласно инструкциям производителя по элюции ДНК. Добавьте 40 µL стерильной дважды дистиллированной воды в каждую лунку связывающей пластины. Случайным образом выберите несколько очищенных ампликонов на пластине для определения концентрации ДНК.

С помощью спектрофотометра NanoDrop доведите концентрацию ампликонов на планшете примерно до 10 ng/µL. Затем используйте рестриктазу EcoRI для переваривания плазмиды, содержащей кассету устойчивости к канамицину, чтобы она могла служить матрицей для ПЦР. Очистите переваренную плазмиду с помощью набора QIAquick PCR Purification Kit и доведите концентрацию линейной плазмидной ДНК до конечного значения 10 ng/µL.

Приготовьте ПЦР-смесь объемом 25 µL для ампликона кассеты устойчивости к канамицину, используя праймеры F two и R two, как указано в письменной процедуре. Следуя данной видеоинструкции, проведите ПЦР-амплификацию. Для анализа ПЦР-продукта выполните гель-электрофорез на 1% агарозном геле.

Затем объедините пулы ампликонов кассеты устойчивости к канамицину от 10 очищенных после ПЦР образцов. Доведите концентрацию ампликонов до 10 nanograms per microliter. Самым сложным этапом данной процедуры является получение конечного линейно компетентного продукта ПЦР из трех исходных продуктов ПЦР.

Для обеспечения успеха количество трех ампликонов ПЦР доводится до почти равного уровня. Смешайте по одному микролитру каждого из трех растворов ампликонов ПЦР с концентрацией 10 нанограмм на микролитр в одной лунке ПЦР-планшета, а также добавьте матрицу ПЦР. Затем приготовьте ПЦР-смесь, включая праймеры F1 и три праймера R, как указано в письменной процедуре.

Затем проведите ПЦР-амплификацию образцов. Проанализируйте ПЦР-ампликоны в агарозном геле после очистки и количественного определения ПЦР-ампликонов. Как и прежде, заморозьте объединенные ПЦР-ампликоны при температуре -20 °C.

Для начала приготовьте среду Todd Hewitt с конским сывороточным дополнением согласно инструкциям в письменном протоколе, сопровождающем данное видео. Отмерьте 2 мл и 10 мл среды в две конические пробирки объемом 15 мл. Инокулируйте 5 µL размороженного стокового штамма s sanguine SK 36, который хранился при температуре -80 °C, в 2 мл среды. Инкубируйте культуру в плотно закрытой пробирке в течение ночи при 37 °C.

Также предварительно инкубируйте пробирку с 10 мл среды в тех же условиях после ночной инкубации. Перенесите 50 µL культуры в пробирку с 10 мл среды. Инкубируйте пробирку при 37 °C в течение трех часов.

Сразу после инкубации добавьте 2 µL стимулирующего компетентность пептида SK 36 в концентрации 70 ng в пробирки на блоке с 96 лунками и предварительно прогрейте их при 37 °C. Перенесите по 330 µL культуры SK 36, инкубированной в течение трех часов, в каждую пробирку. В качестве контроля замените ДНК стерильной дважды дистиллированной водой.

После инкубации выдержите пробирки при 37 °C в течение одного часа. Поместите блок на лед; распределите по 100 µL каждой трансформации на чашки с агаром BHI (brain heart infusion) с содержанием 500 µg/mL канамицина. Инкубируйте чашки при 37 °C в течение двух дней в микроаэробных условиях. Для каждого замещающего мутанта случайным образом выберите две отдельные колонии и инокулируйте каждую колонию в 5 mL среды BHI, содержащей 500 µg/mL канамицина. Инкубируйте каждый инокулят в течение ночи при 37 °C в микроаэробных условиях.

Криоконсервируйте каждую культуру в 30% глицерине при температуре -80 °C. Чтобы проверить, содержит ли мутант ожидаемую замену гена, проведите колониальную ПЦР для каждого мутанта, используя праймеры F1 и R3 в 96-луночном ПЦР-планшете.

Используйте примерно 1 µL ночной культуры каждой отдельной колонии в качестве матрицы ДНК в реакции ПЦР-амплификации объемом 25 µL. Проведите ПЦР-амплификацию для подтверждения замены мутантного гена, чтобы точно идентифицировать мутанты с двойной полосой или contaminating ПЦР-ампликоны. Проанализируйте ПЦР-ампликон с помощью гель-электрофореза в течение четырех часов на геле длиной более 12 cm.

При использовании данных условий электрофореза в 2% agarose gel с окрашиванием бромидом этидия можно четко идентифицировать любые ампликоны, разница в длине которых составляет 100 base pair или более. В качестве альтернативы, если ожидается, что полосы, полученные в результате амплификации кассеты устойчивости к канамицину и гена дикого типа, будут отличаться менее чем на 100 base pair, используйте внутренний праймер T one целевого гена, чтобы определить, можно ли обнаружить ген дикого типа с помощью PCR.

Для дальнейшего подтверждения делеции очистите ампликоны с помощью набора для очистки ПЦР Pure Link 96 и проведите секвенирование с использованием праймера P1, который связывается с кассетой устойчивости к канамицину; оставьте только те правильные мутанты, которые были подтверждены секвенированием после ПЦР-амплификации с использованием праймеров F1 и R1 для вышележащей последовательности, а также F3 и R3 для нижележащей последовательности. Примерно по 1 kb выше и ниже каждого гена s sanguineous были получены в 96-луночном формате при заданных условиях ПЦР с использованием разработанных праймеров.

В каждой ПЦР-реакции из геномной ДНК s sanguineous был амплифицирован специфический продукт, что указало на высокую специфичность праймеров к мишеням s sanguine; это было подтверждено повторной ПЦР-амплификацией с использованием праймеров F1 и R3, где в качестве ДНК-матриц использовались полученные ампликоны. Линейные рекомбинантные ПЦР-конструкты были созданы с высокой пропускной способностью. Рекомбинантные ПЦР-конструкты, состоящие из области выше по течению от каждого целевого гена, кассеты cany и области ниже по течению от каждого целевого гена в указанном порядке, были созданы на 96-луночном планшете, а затем трансформированы в s sanguine SK 36 и отобраны по маркеру cany на чашках с агаром BHI.

В большинстве случаев трансформации после двухдневного микроаэробного инкубирования на каждой чашке было получено более 1000 колоний. При амплификации этих колоний методом ПЦР с использованием праймеров F1 и R3 при попытке делеции потенциально эссенциальных генов с помощью гель-электрофореза наблюдалась одна полоса ДНК, соответствующая ожидаемому размеру мутанта. В большинстве случаев трансформации при делеции некоторых эссенциальных генов колонии должны отсутствовать.

Тем не менее, после трансформации все же были получены колонии; при проведении ПЦР-амплификации этих колоний с использованием праймеров F1 и R на 2D-геле с агарозой и ацетатом натрия (NA) были обнаружены три полосы, соответствующие ожидаемому размеру мутанта и размеру дикого типа, что было подтверждено электрофорезом. Для некоторых мутантов ожидаемый размер ампликона мутанта и размер дикого типа были слишком близки, чтобы их можно было разделить на длинном агарозном геле. В таких случаях на основе последовательности гена дикого типа был разработан внутренний праймер T1 для целевого гена.

ПЦР проводили с использованием внутреннего праймера T one и праймера F1. В качестве положительного контрольного штамма для данной ПЦР использовали дикий тип SK 36. Если при использовании внутреннего праймера из мутанта амплифицировалась полоса ожидаемого размера, ген идентифицировали как эссенциальный ген.

Поскольку наличие кассеты канамицина у мутантов было ранее подтверждено секвенированием ДНК с использованием праймера P1, на основании данного протокола было собрано 2048 мутантов по неэссенциальным генам S. sanguineus. Были исключены те четыре открытые рамки считывания, которые полностью находились внутри других открытых рамок считывания.

В экспериментальных условиях было идентифицировано 218 генов, необходимых для выживания s sanguine. После просмотра этих видео у вас должно появиться четкое представление о том, как проводить полногеномный анализ экспрессии генов с использованием высокопроизводительной ПЦР.