Name: По всему геному Гена удаления в Streptococcus sanguinis По высокая пропускная способность ПЦР (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Узнайте метод высокопроизводительной ПЦР для создания делеций генов во всем геноме Streptococcus sanguinis. Этот подход позволяет эффективно изучать функции бактериальных генов.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана грантами R01DE018138 из Национального института здоровья (ПВ) и, частично, Virginia Commonwealth University президентской программы стимулирования исследований (Прип) 144602-3 (PX). Мы благодарим доктора. Лей Чен, Yuetan Доу и Xiaojing Ван для оказания помощи в строительстве генома широкий мутантов. Мы также благодарим фонд ДНК ядра в Virginia Commonwealth University для секвенирования ДНК.

1. Primer Design <ol><li> Грунтовки предназначены использования в доме сценарии основаны на S. sanguinis SK36 последовательность генома. Три набора праймеров, F1/R1, F2/R2, и F3/R3 предназначены для усиления 1-кб перед последовательностью гена-мишени, APHA-3 ген, кодирующий устойчивость к канамицину (Km г) белка 3 и 1 КБ вниз по течению последовательности гена-мишени, соответственно (рис. 1). Среди этих праймеров, F1 и R3 разработана с использованием ePrimer3 в EMBOSS набор программ ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) для усиления фланкирующие области выше или ниже целевого ген. Гена специфических праймеров, R1 и F3, разработаны основанные на 5 &#39;и 3&#39; последовательности гена-мишени. R1 и F3 праймеры содержат 25-BP адаптер последовательностей в конце их 5 &#39;, которые являются дополнением к APHA-3ген. Температура плавления каждого праймера были разработаны, чтобы быть как можно ближе к 60 ° C, чтобы разрешить использование единой температуры отжига для всех ПЦР-реакции в 96-луночный. </li><li> F1, R1, R3 F3 и праймеры синтезированы в 96-луночные планшеты на основе генного порядка. Каждая пластина содержит один вид грунтовки в том же порядке ген. Развести праймеров в 96-и рабочих грунтовки пластины до конечной концентрации 10 мкМ для ПЦР-амплификации помощью многоканальной пипетки. </li></ol> 2. Высокая пропускная способность ПЦР-амплификации и очистки <ol><li> Для высокой пропускной способностью усиливать 1-кб выше или ниже целевого С. sanguinis генов, собрать смесь ПЦР коктейлей на льду в 15-мл коническую трубку с 1640 мкл DDH 2 O, 250 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 200 мкл 10 мМ смеси дНТФ, 100 мкл 50 мМ MgSO 4, 100 мкл 10 нг / мкл С. sanguinis SK36 геномной ДНК и 10 мкл Taq ДНК Платиновый polymeрасе высокой точностью и передачи 23 мкл смеси в каждую лунку в 96-луночный ПЦР планшет помощью многоканальной пипетки. Передача 1 мкл каждого F1 и R1 (или F3 и R3) от 10 мкМ праймера рабочей пластины к пластине ПЦР с использованием многоканальной пипетки. Печать ПЦР планшет и выполнять усиления при 94 ° С в течение 1 мин, 30 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 54 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 1,5 мин. </li><li> Подготовьте 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий с 48 скважин установки загрузки многоканальной пипетки. Смешайте 4 мкл продукта ПЦР с 1 мкл буфера загрузки 5xDNA на 96-луночный планшет и загрузить образцы на агарозном геле с использованием 10-мкл многоканальной пипетки. Выполнить электрофорез при 135 В в течение 30 мин. Изучите полосы на геле в UVP документации и анализа системы. </li><li> Очищают продуктов ПЦР по PureLink 96 ПЦР-комплект очистки с использованием центрифугирования в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Для элюирования ДНК, добавить 40 мкл стерильной DDH 2 O в яме бinding пластины. </li><li> Случайно выбрать несколько очищенных ампликонов на пластине для изучения ДНК концентраций с использованием NanoDrop спектрофотометр. Отрегулируйте концентрацию ампликонов на тарелке ~ 10 нг / мкл. </li><li> Плазмиды, содержащей Km г кассеты переваривается использованием EcoR я как шаблон ПЦР. Переваривается плазмиды очищают QIAquick набора для очистки ПЦР и линейной плазмидной ДНК доводят до конечной концентрации ДНК 10 нг / мкл. Соберите 25 мкл смеси для Km г кассеты ампликона, в том числе 16,4 мкл DDH 2 O, 2,5 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 2 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 1 мкл 50 мМ Mg SO 4, 1 мкл 10 мкМ F2, 1 мкл 10 мкМ R2, 1 мкл линейной плазмидной ДНК и 0,1 мкл Taq Платиновый ДНК-полимераза с высокой точностью. Выполните ПЦР-амплификации при 94 ° С в течение 1 мин, 30 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° С в течение 1 мин. Изучить продукт ПЦР помощью гель-электрофореза в 1% агарозном. Pooла большую часть кассеты Km г ампликона из 10 отдельных ПЦР очищали с помощью набора для очистки QIAquick ПЦР. Отрегулируйте ампликона концентрации до 10 нг / мкл. </li><li> Для получения окончательного линейного рекомбинантного ампликонов PCR, три ПЦР ампликонов сочетаются друг с 1 мкл (почти в равных молярных количествах) в одной ПЦР планшет также ПЦР шаблона. Другие компоненты ПЦР добавлены в том числе 14,4 мкл DDH 2 O, 2,5 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 2 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 1 мкл 50 мМ Mg SO 4, 1 мкл 10 мкМ F1, 1 мкл 10 мкМ R3, 0,1 мкл Taq Платиновый ДНК-полимераза с высокой точностью. ПЦР-амплификации проводят при 94 ° С в течение 2 мин, 30 циклов при 94 ° C в течение 30 сек 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 3,5 мин, и, наконец, 68 ° C в течение 4 мин. </li><li> Изучите ПЦР ампликонов на агарозном геле. Очищают и количественной ПЦР ампликонов как описано выше. Замораживание рекомбинированные ампликонов PCR при -20 ° C. </li></ol> 3. ComПодготовка компетентных клетках <ol><li> Тодд Хьюитт бульон готов, скорректированная рН до 7,6 с помощью 10 N NaOH, нагревают до кипения, а затем охлаждают до комнатной температуры и стерилизовать с использованием 0,22 мкм полистирола фильтр 4. Добавить 300 мкл инактивированной сыворотки лошади (конечная концентрация 2,5%) до 11,7 мл бульона Todd Hewitt в 15-мл коническую трубку составить TH + HS среды. Алиготе TH + HS среду в 2 мл и 10 мл в пробирки. </li><li> Инокулировать 5 мкл на складе С. sanguinis SK36 замораживали при -80 ° C в 2 мл TH средний + HS и инкубировать в течение ночи с культурой укупорки плотно при 37 ° С, сопровождается предварительной инкубации 10 мл-TH + HS трубку. </li><li> После ночи, трансфер 50 мкл культуры в 10 мл TH + HS и инкубировать в трубке при 37 ° C в течение 3 часов (соответствует OD 660 из 0,07-0,08), сразу же использовать для преобразования. </li></ol> 4. Трансформации клеток и Антибиотик выбора <ol><li> Добавить 2 мкл 70 нг С. sanguinis SK36 компетенцийществования стимулирующий пептид (CSP) и 2 мкл линейного рекомбинантного ПЦР ампликона (~ 50 нг), чтобы Эппендорфа на 96-луночный блок и предварительно нагреть их при температуре 37 ° C. Передача 330 мкл 3 час-инкубационных SK36 культуры в каждую пробирку. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Заменить ДНК стерильной DDH 2 O в качестве контроля. </li><li> Установите блок на льду и распространился 100 мкл каждого преобразования на мозг сердце инфузии (BHI) агар пластины с 500 мкг / мл канамицина. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C в течение 2 сут при микроаэробных условиях. </li></ol> 5. Мутант подтверждения и хранения <ol><li> Для каждой замены мутант, случайно подхватывать 2 отдельных колоний, привить колонии в 5 мл BHI, содержащий 500 мкг / мл канамицина и инкубировать посевной microaerobically течение ночи при 37 ° C. Криоконсервируют каждой культуре в 30% глицерине при -80 ° C </li><li> Чтобы изучить вопрос о мутанта содержащий ген ожидается замена, выполнить ПЦР колоний для каждого мутанта с помощью F1 и R3праймеров в 96-луночный планшет ПЦР. О 1-мкл ночной культуры из отдельных колоний используют в качестве ДНК-матрицы в 25-мкл ПЦР-реакции амплификации. ПЦР проводят при 94 ° C в течение 5 мин, 35 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 3,5 мин, и, наконец, 68 ° C в течение 4 мин. </li><li> Чтобы точно определить двойной группой мутантов или загрязнения ампликона ПЦР, ПЦР изучить ампликона с помощью электрофореза в течение 4 часов на&gt; 12 см длиной 2% агарозном геле с окрашиванием этидийбромидом. В соответствии с этим условием электрофореза в агарозном геле, любой ампликонов с разницей ≥ 100 б.п. были четко определены. Когда полосы в результате усиления кассеты г Km и дикий тип гена, как ожидается, отличаются &lt;100 б.п., внутреннего праймера T1 используется для определения, является ли ген дикого типа могут быть обнаружены с помощью ПЦР. </li><li> Для дальнейшего подтверждения удаления ампликонов очищают PureLink 96 набора для очистки ПЦР и секвенировали с использованием P1 праймер,связывается с кассетой г Км. Хранить только правильные мутантов подтвердить путем секвенирования. </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Чтобы свести к минимуму возможные полярные эффекты замены одного целевого гена с экзогенного гена антибиотиков на соседние гены, две шаги при начальном проектировании грунтовки. Для большинства удалены гены, праймеры R1 и F3 предназначены для удаления кодирующей области от 6 б.п. после стартового кодона на 30 б.п. до стоп-кодона. За последние 30 пар оснований сохранить для защиты потенциальных сайта связывания рибосом используется соседними по потоку генов. Сохранила области между двумя соседними генами распространяется...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Имена</strong</td&gt;<td<strong&gt; О компании</strong</td&gt;<td<strong&gt; Каталог #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Комментарии (по желанию)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Комплексная ДНК-технологии</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer R2</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2p</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P1</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P2</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Там же</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Последовательность: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ДНК-полимеразы</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq ДНК-полимеразы High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Рестрикционный</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Агар</td&gt;<td&gt; Американские Биоаналитическая</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Агароза</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Brain сердца Инфузионная</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Лошадиной сыворотки</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Лошадиной сыворотки</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Канамицин</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH бульоне</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Todd Hewitt бульоне</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 ПЦР-комплект очистки</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick ПЦР-комплект очистки</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Фильтр</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0,22 мкм полистирола фильтр</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomat системы</td&gt;<td&gt; Mart микробиологии BV</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Настольные центрифуги</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Plus планшет ротором</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Гель Документация</td&gt;<td&gt; UVP ООО</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Инкубатор</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet по Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet по Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Микроцентрифуга</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Микроцентрифуга 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Многоканальные пипетки</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Термоциклер</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Инк</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp ПЦР-системы 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

По всему геному Гена удаления в<em&gt; streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Транспозонов мутагенеза и одного гена удаления двух методов, применяемых в генома генов нокаутом в 1,2 бактерии. Хотя транспозона мутагенеза является менее трудоемким и менее дорогостоящими, и не требует завершить геноме информации, есть два слабых места в этом методе: (1) возможность разных мутантов в смешанном мутант библиотека, которая по борьбе с мутантами выбирает со снижением конкуренции; и (2) возможность частичной инактивации гена которой гены не полностью теряют свои функции после введения транспозона. Одного гена удаления анализа могут компенсировать недостатки, связанные с мутагенеза транспозонов. Для повышения эффективности генома одного делеции гена, мы пытаемся установить высокую пропускную техника для генома одного удаления гена с использованием Streptococcus sanguinis в качестве модельного организма. Каждый ген удаления построить в S. sanguinis генома предназначен для составляющих 1КБ вверх по течению от целевого гена, APHA-3 гена, кодирующего белок канамицину и 1-кб ниже целевого гена. Три комплекта F1/R1 грунтовки, F2/R2, и F3/R3, соответственно, разработан и синтезирован в 96-луночный планшет формата для ПЦР-амплификации из этих трех компонентов каждого удаления построить. Грунтовки R1 и F3 содержат 25-BP последовательности, которые являются дополнением к регионам APHA-3 гена в конце их 5. Крупномасштабных ПЦР-амплификации APHA-3 гена выполняется один раз для создания всех одно-генных конструкций удаления. Промоутер APHA-3 гена изначально исключены чтобы свести к минимуму потенциальные полярный эффект кассетного канамицин. Для создания конструкции гена удаления, высокой пропускной ПЦР-амплификации и очистки осуществляется в 96-луночный планшет формата. Линейные рекомбинантного ампликона ПЦР для каждого гена удаление будет составлен через четыре реакции ПЦР с использованием высококачественных ДНК-полимеразы. Первоначальный EXPONдифференциальной фазы роста S. sanguinis культивировали в Todd Hewitt бульоне с добавлением 2,5% инактивированной лошадиной сыворотки используется для повышения компетенции для преобразования ПЦР-рекомбинантной конструкции. При этом условии до 20% С. sanguinis клетки могут быть трансформированы ~ 50 нг ДНК. Основываясь на этом подходе, 2048 мутанты с одного гена удаления в конечном итоге были получены из 2270 генов S. sanguinis учета ORFs четыре гена, целиком в рамках других ORFs в S. sanguinis SK36 и 218 потенциальных существенных генов. Техника на создание конструкции ген удаления высокой пропускной способностью и может быть легко использовать в генома одного удаления гена для любого трансформируемые бактерий.

После ПЦР-амплификации с использованием праймеров F1 и R1, и F3 и R3, около 1-кб до и после каждого S. sanguinis генов были получены в 96-луночный, соответственно (рис. 2A). В наших условиях ПЦР и использовании предназначен грунтовки, конкретный продукт был амплифицирован из S. sanguinis геномной ДНК в каждой реакции ПЦР. Этот результат указывает на праймеров были весьма специфическими для целей S. sanguinis. С помощью ПЦР-амплификации повторно с использованием праймеров F1 и ...

Эффективное генома одного метода генной мутации была создана использования<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; В качестве модельного организма. Этот метод осуществляется через высокую пропускную способность рекомбинантного ПЦР и преобразований.

По всему геному Гена удаления в<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Транспозонный мутагенез и делеция одного гена — это два метода, применяемых для полногеномного нокаута генов у бактерий 1,2. Хотя транспозонный мутагенез представляет собой...

Общая цель данной процедуры заключается в осуществлении полногеномного делетирования одиночных генов у streptococcus sanguine с помощью высокопроизводительной ПЦР. Это достигается путем первоначального получения трех ампликонов посредством высокопроизводительной ПЦР-амплификации, включая ген устойчивости к антибиотикам, а также выше- и нижележащие последовательности ДНК целевого гена. На втором этапе получается линейный рекомбинантный ПЦР-ампликон, используя три ПЦР-ампликона в качестве матриц.Затем подготавливают компетентные клетки s sanguine. Заключительным этапом является трансформация линейного рекомбинантного ПЦР-ампликона в компетентные клетки s sanguine. В итоге для проверки правильности мутаций используют ПЦР-амплификацию колоний и секвенирование ДНК.Основным преимуществом данной методики перед другими исчерпанными методами, такими как нокаут с помощью суицидальных плазмид, является возможность создания делеционного мутанта в масштабе всего генома непосредственно с применением высокопроизводительного анализа. Праймеры для ПЦР могут быть сконструированы и синтезированы согласно описанному в письменном протоколе способу с использованием внутренних скриптов на основе последовательности генома streptococcus sanguineous SK 36. Были разработаны три набора праймеров для амплификации последовательности длиной 1 kb выше по течению от целевого гена, кодирующей области гена A PHA three ENC, белка устойчивости к канамицину и последовательности длиной 1 kb ниже по течению от целевого гена.Ген-специфические праймеры. R1 и F3 разработаны на основе 5'- и 3'-последовательностей целевого гена для высокопроизводительной амплификации области размером 1 kb выше или ниже целевых генов s sanguine. Сначала приготовьте смесь для ПЦР в 15-мл конической пробирке на льду.См. текст для определения компонентов смеси для ПЦР, содержащей геномную ДНК s sanguineous; перенесите 23 µL смеси в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета с помощью многоканального дозатора. Для амплификации вышележащей последовательности целевого гена перенесите по 1 µL праймеров F1 и R1 из рабочих планшетов с праймерами концентрацией 10 µM в ПЦР-планшет с помощью многоканального дозатора. Аналогично поступите с праймерами F3 и R3 для амплификации нижележащей последовательности целевого гена. Закройте ПЦР-планшет и проведите амплификацию при 94 °C в течение 1 минуты, затем выполните 30 циклов при 94 °C в течение 30 секунд.54 °C в течение 30 секунд и 68 °C в течение 1,5 минут. После амплификации приготовьте 1% agarose gel, содержащий подходящий бромид, с 48 лунками, подходящими для загрузки многоканальным дозатором. Смешайте 4 µL продукта ПЦР с 1 µL 5X DNA loading buffer.На планшет с 96 лунками внесите образцы в агарозный гель с помощью 10 µL многоканального дозатора. Проведите электрофорез при 135 вольтах в течение 30 минут. Проанализируйте полосы на геле с помощью системы визуализации и анализа UVP.Очистите продукты ПЦР с помощью набора Pure Link 96 PCR Purification Kit методом центрифугирования согласно инструкциям производителя по элюции ДНК. Добавьте 40 µL стерильной дважды дистиллированной воды в каждую лунку связывающей пластины. Случайным образом выберите несколько очищенных ампликонов на пластине для определения концентрации ДНК.С помощью спектрофотометра NanoDrop доведите концентрацию ампликонов на планшете примерно до 10 ng/µL. Затем используйте рестриктазу EcoRI для переваривания плазмиды, содержащей кассету устойчивости к канамицину, чтобы она могла служить матрицей для ПЦР. Очистите переваренную плазмиду с помощью набора QIAquick PCR Purification Kit и доведите концентрацию линейной плазмидной ДНК до конечного значения 10 ng/µL.Приготовьте ПЦР-смесь объемом 25 µL для ампликона кассеты устойчивости к канамицину, используя праймеры F two и R two, как указано в письменной процедуре. Следуя данной видеоинструкции, проведите ПЦР-амплификацию. Для анализа ПЦР-продукта выполните гель-электрофорез на 1% агарозном геле.Затем объедините пулы ампликонов кассеты устойчивости к канамицину от 10 очищенных после ПЦР образцов. Доведите концентрацию ампликонов до 10 nanograms per microliter. Самым сложным этапом данной процедуры является получение конечного линейно компетентного продукта ПЦР из трех исходных продуктов ПЦР.Для обеспечения успеха количество трех ампликонов ПЦР доводится до почти равного уровня. Смешайте по одному микролитру каждого из трех растворов ампликонов ПЦР с концентрацией 10 нанограмм на микролитр в одной лунке ПЦР-планшета, а также добавьте матрицу ПЦР. Затем приготовьте ПЦР-смесь, включая праймеры F1 и три праймера R, как указано в письменной процедуре.Затем проведите ПЦР-амплификацию образцов. Проанализируйте ПЦР-ампликоны в агарозном геле после очистки и количественного определения ПЦР-ампликонов. Как и прежде, заморозьте объединенные ПЦР-ампликоны при температуре -20 °C.Для начала приготовьте среду Todd Hewitt с конским сывороточным дополнением согласно инструкциям в письменном протоколе, сопровождающем данное видео. Отмерьте 2 мл и 10 мл среды в две конические пробирки объемом 15 мл. Инокулируйте 5 µL размороженного стокового штамма s sanguine SK 36, который хранился при температуре -80 °C, в 2 мл среды. Инкубируйте культуру в плотно закрытой пробирке в течение ночи при 37 °C.Также предварительно инкубируйте пробирку с 10 мл среды в тех же условиях после ночной инкубации. Перенесите 50 µL культуры в пробирку с 10 мл среды. Инкубируйте пробирку при 37 °C в течение трех часов.Сразу после инкубации добавьте 2 µL стимулирующего компетентность пептида SK 36 в концентрации 70 ng в пробирки на блоке с 96 лунками и предварительно прогрейте их при 37 °C. Перенесите по 330 µL культуры SK 36, инкубированной в течение трех часов, в каждую пробирку. В качестве контроля замените ДНК стерильной дважды дистиллированной водой.После инкубации выдержите пробирки при 37 °C в течение одного часа. Поместите блок на лед; распределите по 100 µL каждой трансформации на чашки с агаром BHI (brain heart infusion) с содержанием 500 µg/mL канамицина. Инкубируйте чашки при 37 °C в течение двух дней в микроаэробных условиях. Для каждого замещающего мутанта случайным образом выберите две отдельные колонии и инокулируйте каждую колонию в 5 mL среды BHI, содержащей 500 µg/mL канамицина. Инкубируйте каждый инокулят в течение ночи при 37 °C в микроаэробных условиях.Криоконсервируйте каждую культуру в 30% глицерине при температуре -80 °C. Чтобы проверить, содержит ли мутант ожидаемую замену гена, проведите колониальную ПЦР для каждого мутанта, используя праймеры F1 и R3 в 96-луночном ПЦР-планшете.Используйте примерно 1 µL ночной культуры каждой отдельной колонии в качестве матрицы ДНК в реакции ПЦР-амплификации объемом 25 µL. Проведите ПЦР-амплификацию для подтверждения замены мутантного гена, чтобы точно идентифицировать мутанты с двойной полосой или contaminating ПЦР-ампликоны. Проанализируйте ПЦР-ампликон с помощью гель-электрофореза в течение четырех часов на геле длиной более 12 cm.При использовании данных условий электрофореза в 2% agarose gel с окрашиванием бромидом этидия можно четко идентифицировать любые ампликоны, разница в длине которых составляет 100 base pair или более. В качестве альтернативы, если ожидается, что полосы, полученные в результате амплификации кассеты устойчивости к канамицину и гена дикого типа, будут отличаться менее чем на 100 base pair, используйте внутренний праймер T one целевого гена, чтобы определить, можно ли обнаружить ген дикого типа с помощью PCR.Для дальнейшего подтверждения делеции очистите ампликоны с помощью набора для очистки ПЦР Pure Link 96 и проведите секвенирование с использованием праймера P1, который связывается с кассетой устойчивости к канамицину; оставьте только те правильные мутанты, которые были подтверждены секвенированием после ПЦР-амплификации с использованием праймеров F1 и R1 для вышележащей последовательности, а также F3 и R3 для нижележащей последовательности. Примерно по 1 kb выше и ниже каждого гена s sanguineous были получены в 96-луночном формате при заданных условиях ПЦР с использованием разработанных праймеров.В каждой ПЦР-реакции из геномной ДНК s sanguineous был амплифицирован специфический продукт, что указало на высокую специфичность праймеров к мишеням s sanguine; это было подтверждено повторной ПЦР-амплификацией с использованием праймеров F1 и R3, где в качестве ДНК-матриц использовались полученные ампликоны. Линейные рекомбинантные ПЦР-конструкты были созданы с высокой пропускной способностью. Рекомбинантные ПЦР-конструкты, состоящие из области выше по течению от каждого целевого гена, кассеты cany и области ниже по течению от каждого целевого гена в указанном порядке, были созданы на 96-луночном планшете, а затем трансформированы в s sanguine SK 36 и отобраны по маркеру cany на чашках с агаром BHI.В большинстве случаев трансформации после двухдневного микроаэробного инкубирования на каждой чашке было получено более 1000 колоний. При амплификации этих колоний методом ПЦР с использованием праймеров F1 и R3 при попытке делеции потенциально эссенциальных генов с помощью гель-электрофореза наблюдалась одна полоса ДНК, соответствующая ожидаемому размеру мутанта. В большинстве случаев трансформации при делеции некоторых эссенциальных генов колонии должны отсутствовать.Тем не менее, после трансформации все же были получены колонии; при проведении ПЦР-амплификации этих колоний с использованием праймеров F1 и R на 2D-геле с агарозой и ацетатом натрия (NA) были обнаружены три полосы, соответствующие ожидаемому размеру мутанта и размеру дикого типа, что было подтверждено электрофорезом. Для некоторых мутантов ожидаемый размер ампликона мутанта и размер дикого типа были слишком близки, чтобы их можно было разделить на длинном агарозном геле. В таких случаях на основе последовательности гена дикого типа был разработан внутренний праймер T1 для целевого гена.ПЦР проводили с использованием внутреннего праймера T one и праймера F1. В качестве положительного контрольного штамма для данной ПЦР использовали дикий тип SK 36. Если при использовании внутреннего праймера из мутанта амплифицировалась полоса ожидаемого размера, ген идентифицировали как эссенциальный ген.Поскольку наличие кассеты канамицина у мутантов было ранее подтверждено секвенированием ДНК с использованием праймера P1, на основании данного протокола было собрано 2048 мутантов по неэссенциальным генам S. sanguineus. Были исключены те четыре открытые рамки считывания, которые полностью находились внутри других открытых рамок считывания.В экспериментальных условиях было идентифицировано 218 генов, необходимых для выживания s sanguine. После просмотра этих видео у вас должно появиться четкое представление о том, как проводить полногеномный анализ экспрессии генов с использованием высокопроизводительной ПЦР.

genome-wide-gene-deletions-streptococcus-sanguinis-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Систематические крупномасштабные синтетические генетические (ген-ген или эпистаза) экранов взаимодействия может быть использована для изучения генетической избыточности и пути перекрестных помех. Здесь мы описываем высокой пропускной количественные синтетических генетических технологий скрининга массив, называемый eSGA, которые мы разработали для выяснения отношений эпистатических и изучение генных сетей взаимодействия...

Сопоставление бактериальных функциональных сетей и путей в<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Использование синтетических генетических массивы

Зеленый монстр метод позволяет быструю сборку нескольких удалений отмечены кодирования гена-репортера зеленого флуоресцентного белка. Этот метод основан на вождение штаммов дрожжей через повторяющиеся циклы сексуальных ассортимент удалений и флуоресценции на основе обогащения клеток, несущих более удалений.

Зеленый монстр процесса генерации штаммов дрожжей проведение нескольких удалений Гена

Источник: Tomás, J.M., et al. Генерация нулевых мутантов для выяснения роли бактериальных гликозилтрансфераз в бактериальной подвижности. J. Vis. Exp. (2022).В этом видео показана инициирующая амплификация плазмиды самоубийцы в E. coli. Плазмида, несущая ген устойчивости к антибиотикам, реплицируется только в присутствии белка-инициатора, кодируемого хозяином. После электропорации и инкубации в восстановительной среде смесь наносится на антибиотиксодержащий агар. Бактерии с плазмидой выживают,...

Амплификация плазмиды самоубийцы в бактериальном хозяине

CRISPR/Cas9 — это надежная система для разрушения генов и генетических элементов. Здесь мы описываем протокол для эффективного создания геномных делеций в клеточных линиях млекопитающих с использованием CRISPR/Cas9.

Генерация геномных делеций в линии клеток млекопитающих, через CRISPR / Cas9

К экспериментальной проверке активности энхансера лучше всего подходит анализ потери функции. Здесь представлен эффективный протокол, который использует CRISPR/Cas9-опосредованную делецию для изучения аллель-специфической регуляции транскрипции генов в клетках F1 ES, которые содержат гибридный геном (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Создание CRISPR / cas9 опосредованного моноаллельной Пропуски для изучения Enhancer Функция в эмбриональных стволовых клетках мышей

Эта рукопись описывает дуплексный цифровой анализ ПЦР , который может использоваться для одновременного количественного определения Enterococcus SPP. И HF183 генетические маркеры , как показатели общего и человеческого ассоциированного фекального загрязнения в рекреационных водах.

Дуплексной связи с цифровой ПЦР-анализ для одновременного Количественное определение<em&gt; Enterococcus SPP.</em&gt; И человеческая Фекальные-ассоциированный HF183 Marker в водах

Мы описываем легким, быстрым и относительно недорогой метод для генерации ген нарушена Streptococcus mutans штаммов; Эта техника может быть адаптирована для поколения ген нарушена штаммов различных видов.

Поколение ген нарушена Streptococcus mutans штамм без генов клонирования

Здесь мы представляем собой протокол для использования уже существующих антибиотикам сопротивление кассета удаления конструкции как основу для принятия удаления мутантов в других штаммов E. coli . Такие перегласовки удаления могут быть мобилизованы и вставлен в соответствующий Локус штамм получателей с помощью P1 бактериофага трансдукции.

Производство гена удалений в Escherichia coli , P1 трансдукция с подакцизных антибиотикорезистентности кассеты

Описан опростываемый здесь простой метод очистки генного продукта в Streptococcus mutans. Этот метод может быть выгодным в очищении белков, особенно мембранных белков и белков высокой молекулярной массы, и может быть использован с различными другими бактериальными видами.

Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans

Описанный здесь метод для целенаправленного, маркеров удаления генов в Chlamydia trachomatis с помощью флексной кассеты аллельный обмен мутагенез, FLAEM.

Безмаркеров удаление генов Флексед Кассета Аллелик Обмен Мутагенез в chlamydia trachomatis

Здесь мы опишем построение нулевых мутантов Aeromonas в специфических гликозилтрансферазах или областях, содержащих гликозилтрансферазы, анализы подвижности и очистку жгутиков, выполненные для установления участия и функции их кодируемых ферментов в биосинтезе гликана, а также роль этого гликана в бактериальном патогенезе.

Генерация нулевых мутантов для выяснения роли бактериальных гликозилтрансфераз в бактериальной подвижности

Узнайте метод высокопроизводительной ПЦР для создания делеций генов во всем геноме Streptococcus sanguinis. Этот подход позволяет эффективно изучать функции бактериальных генов.

По всему геному Гена удаления в

Больше видео