Изоляция первичных меланоцитов-подобных клеток из Сердца Mouse

Общая цель данной процедуры заключается в выделении жизнеспособных кардиальных меланоцитоподобных клеток из сердца мыши. Сначала из эвтаназированных мышей извлекают сердца. На втором этапе сердца измельчают и подвергают диссоциации клеток с помощью ферментативного переваривания и механического воздействия.

Затем суспензию клеток центрифугируют, а осадок, содержащий кардиомиоциты и меланоцитоподобные клетки, ресуспендируют. Заключительный этап — посев и культивирование. Изолированные в итоге кардиальные меланоцитоподобные клетки могут быть использованы для патч-кламп исследований или микрочипового анализа в ответ на патофизиологический стресс-фактор для оценки возбудимости клеток или состояния транскриптома.

Основным преимуществом данного метода перед существующими способами изоляции и культивирования кардиомиоцитов является возможность выделения большого количества жизнеспособных клеток, подобных сердечным меланоцитам. Идея этого метода возникла у нас после обнаружения новой популяции клеток в сердце мыши, когда мы решили изучить их физиологию. Для начала подготовьте два набора стерильных хирургических инструментов: один для извлечения сердец, другой — для измельчения ткани.

Затем подготовьте добавки к среде, но не добавляйте их в культуральную среду до момента посева клеток. После приготовления культуральной среды профильтруйте её для стерилизации раствора, работая в ламинарном шкафу, и храните среду при температуре 4 °C. Приготовьте раствор DNA's one, добавив 0,05 г DNA's one к 100 мл DPBS с 10% FBS и антибиотиками.

Затем приготовьте 0,5% раствор трипсина, добавив 0,5 г трипсина в 100 мл DPBS с антибиотиками. В завершение подготовьте остальное оборудование, необходимое для выполнения процедуры, включая чашки Петри, конические пробирки объемом 50 мл, клеточные фильтры с порами 40 мкм, DPBS с антибиотиками, культуральные чашки диаметром 60 мм и 35 мм. После эвтаназии новорожденных мышат от P0 до P2 протрите их грудную клетку спиртом и поместите их в чашку P2 диаметром 10 см. Работая под стереомикроскопом, осторожно вскройте грудную полость и извлеките сердце целиком вместе с предсердиями.

Промойте сердца в DPBS и перенесите их в новую чашку Петри диаметром 10 сантиметров. Поместите чашку Петри с вырезанными сердцами в ламинарный шкаф и соблюдайте правила стерильности при выполнении следующих действий. Сначала трижды промойте сердца в стерильном DPBS с добавлением антибиотиков.

Поместите сердца в чашку для культивирования диаметром 60 мм и добавьте от 6 до 8 мл 0,5% раствора трипсина. Затем разрежьте сердца на мелкие фрагменты и инкубируйте их при 37 °C в течение 30 минут. По завершении инкубации перенесите полученный раствор из чашки в стерильную коническую пробирку объемом 10 мл.

С помощью стерильной пипетки объемом 10 мл быстро, но осторожно перенесите раствор из одной емкости в другую 30–50 раз, затем профильтруйте полученную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 40 мкм в новую чистую коническую пробирку объемом 50 мл. После центрифугирования аккуратно аспирируйте супернатант и ресуспендируйте оставшийся осадок в 6–8 мл стерильного DPBS. Повторите этот шаг еще два раза.

После третьего промывания после центрифугирования осторожно слейте или аспирируйте промывочный раствор и ресуспендируйте осадок в шести миллилитрах дополненной культуральной среды. Затем наберите ресуспендированный раствор в стерильную переносную пипетку и перенесите клетки в чашку диаметром 35 миллиметров. После инкубации в течение ночи извлеките изолированные кардиомиоциты трех новорожденных мышей, аспирируйте культуральную среду вместе с любыми несидевшими клетками, затем однократно промойте чашки с помощью DPBS, добавьте в чашки свежую среду и замените ее.

Клетки, выделенные из сердец новорожденных или эмбрионов, могут поддерживаться в культуре до трех недель при смене среды каждые два дня, в то время как клетки, выделенные из сердец взрослых особей, могут поддерживаться в культуре до 10 дней. Чтобы выделить меланоцитоподобные клетки из сердца взрослой мыши, сначала промойте иссеченные сердца в стерильном DPBS с антибиотиками в ламинарном шкафу для культивирования тканей. Слегка сожмите сердце изогнутым анатомическим пинцетом, чтобы удалить остатки крови, а затем промойте сердце в DPBS еще раз.

Затем удалите предсердия и предсердно-желудочковое кольцо из сердец и поместите вырезанные образцы ткани в чашку диаметром 35 мм. Разрежьте сердца на мелкие фрагменты, используя изогнутые ножницы и пинцет. Добавьте в чашку от 6 до 8 мл 0,5% раствора трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 45–60 минут.

После инкубации повторите шаги, продемонстрированные ранее, чтобы получить суспензию взрослых клеток сердца и высеять их на планшеты. В данном примере белая стрелка на обеих панелях указывает на кардиальный меланоцит. Обратите внимание, что без помощи флуоресцентного маркера кардиальный меланоцит трудно идентифицировать и отличить от прикрепленных к чашке миоцитов предсердий; светло-голубая стрелка указывает на клетки предсердий, которые плохо прикрепились к чашке, показанной здесь, где представлены здоровые кардиальные меланоциты, выделенные из сердца новорожденной мыши.

Они развили обширные дендритные отростки и по своему строению тесно напоминают кожные меланоциты. После освоения эта методика может быть выполнена за несколько часов при условии правильного соблюдения протокола. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как выделить жизнеспособные клетки меланоцитов из сердца.

Это будет подходящим для физиологического и молекулярного анализа.