Новый метод культуры и поляризованный Стимуляция кишечника человека Экспланты Слизистая

Общая цель следующего эксперимента заключается в имитации условий in vivo для стимуляции слизистой оболочки кишечника человека. Это достигается путем приклеивания полого цилиндра к апикальной стороне ткани, чтобы предотвратить контакт стимула с базолатеральной стороной. На втором этапе вводится стимул, что позволит проанализировать вызванный иммунный ответ.

Затем стимул удаляют с апикальной стороны ткани, чтобы сохранить ее жизнеспособность в течение 24–36 часов. Полученные результаты могут демонстрировать дифференциальные эффекты различных пробиотических штаммов на основании данных иммуногистохимии, секреции цитокинов, профильного анализа и так далее. Основным преимуществом этого метода перед существующими, такими как камера ASIC, является возможность одновременного анализа до 20 условий.

Это позволяет увеличить время культивирования до 36 часов, а также обеспечивает достаточное количество материала для различных видов анализа, таких как анализ ДНК/РНК, иммуногистохимия, определение секреции цитокинов и так далее. Хотя данный метод может дать ценные сведения в области изучения пробиотиков, его также можно использовать для других технологий и изучения эффекта иных иммуномодуляторов, таких как биологические препараты, противовоспалительные средства и др. Ткань слизистой оболочки кишечника здоровых лиц или пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника должна быть получена в ходе хирургического вмешательства.

После иссечения образца его следует быстро перенести в лабораторию, поддерживая охлажденным в HBSS с пенициллином и стрептомицином. Затем промойте ткань буфером и удалите любые брыжеечные структуры. После этого, удерживая ткань в буфере HBSS, отделите слой слизистой оболочки от подслизистого слоя с помощью стерильных ножниц и пинцета.

В чашке Петри нет необходимости полностью погружать ткань в жидкость, однако следует максимально ограничить касание слизистой поверхности пинцетом. Затем разрежьте слизистую на полоски шириной не менее одного сантиметра и максимально возможной длины, используя два стерильных скальпеля по принципу нарезки пищи. После разрезания осторожно промойте и очистите слизистую в HBSS без содержания кальция и магния.

Наконец, разложите полоски слизистой оболочки в чашке Петри апикальной стороной вверх. Начните с приготовления свежей среды TIS DMEM. Затем налейте в чашку Петри диаметром 10 сантиметров около 30 миллилитров F-B-S-N-A и полностью погрузите в раствор железную сетку.

Оставьте планшет открытым и расположите на нем пластиковые цилиндры.Крышку. Теперь наберите три микролитра хирургического клея в пипетку и осторожно нанесите клей на один из краев пластикового цилиндра, плотно удерживая его пинцетом. Затем аккуратно установите цилиндр на апикальную сторону слизистой оболочки как можно ближе к одному из краев полоски, пока клей высыхает.

Расположите от 850 до 1000 µL среды в центральную лунку планшета для тканей и установите металлическую сетку на края центральной лунки. С помощью двух скальпелей срежьте излишки ткани по краям цилиндра. Затем осторожно поднимите цилиндр с прикрепленной к нему тканью и поместите базолатеральную сторону ткани на металлическую сетку в центре планшета.

Затем переходите к стимуляции ткани. Нанесите необходимые стимулы в центр пластикового цилиндра в желаемой концентрации. Не касайтесь кончиком пипетки стенок цилиндра или слизистой поверхности, равномерно покрывая поверхность внутри цилиндра.

Теперь инкубируйте ткань в течение максимум трех часов. Инкубация более трех часов также возможна при использовании меньшего объема раствора стимулятора. После инкубации удалите стимуляторы с апикальной поверхности ткани, не заменяя их свежей средой.

Добавление среды приведет к асфиксии ткани. Теперь заполните кислородную камеру 100% кислородом под давлением в одну атмосферу на 24 часа культивирования. Соблюдайте осторожность при работе с кислородным баллоном и обязательно плотно закрывайте его после использования.

После 24-часового стимулирующего культивирования осторожно извлеките цилиндр из ткани с помощью скальпеля, аккуратно счистив клей. Затем, для проведения иммуногистохимического анализа или иммунофлуоресцентного анализа, зафиксируйте ткань. Для анализа экспрессии генов или анализа белков подвергните ткань мгновенной заморозке в жидком азоте.

Затем соберите базальную латеральную среду для профилирования секреции цитокинов. После этого перенесите среду в центрифужную пробирку и осадите клеточный дебрис, следуя описанному протоколу. Здоровая слизистая оболочка кишечника человека и слизистая оболочка при ВЗК культивировались в течение как минимум 24 часов с сохранением жизнеспособности тканей.

Это стало возможным только в том случае, если не менее 85% времени культивирования проходило в среде, богатой кислородом. Слизистая оболочка, выращенная традиционным способом, демонстрирует худшие результаты. Затем здоровую ткань стимулировали про-воспалительной инвазивной сальмонеллой.

Через два часа после инокуляции по сравнению с контролем уже было заметно разрушение верхнего слоя эпителия. Спустя 24 часа дегенерация стала весьма обширной. Более детальное обсуждение практического применения в экспериментах с опубликованными результатами представлено в рукописи после ее завершения.

Эта методика открыла исследователям в области гастроэнтерологии возможность изучать взаимодействие микробов и организма хозяина в желудочно-кишечном тракте. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как поддерживать культуру слизистой оболочки кишечника человека и проводить её местную стимуляцию. Не забывайте, что работа с образцами человеческого происхождения может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать все необходимые меры предосторожности.