Функциональная магнитно-резонансной томографии (МРТ) с звуковой стимуляции в Певчие птицы

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать оптимизированный протокол для успешной визуализации восприятия и обработки звука в слуховых областях и областях контроля песни в мозге певчей птицы. С помощью функциональной МРТ это достигается путем предварительной подготовки высококачественных слуховых стимулов, которые могут быть интегрированы в парадигму блоков «включение-выключение» для предъявления птице во время функционального МРТ или фМРТ сканирования. Вторым шагом является подготовка птицы к сканированию, которая включает в себя проведение анестезии и последующее размещение животного на адаптированном ложе, которое затем помещается в апертуру МРТ-сканера. После этого можно приступать к получению фМРТ-изображений в процессе слуховой стимуляции.

Заключительным этапом является предварительная обработка полученных данных МРТ, включая нормализацию изображений по атласу мозга зебровой амадины. В конечном итоге используется статистический воксельный анализ для визуализации полученных результатов и локализации активаций мозга, вызванных слуховыми стимулами. Основное преимущество этого метода перед другими, более распространенными в исследованиях нектарниц методами, такими как электрофизиология, гистология и методы молекулярного картирования, заключается в том, что фМРТ является неинвазивным методом in vivo, который позволяет изучать одного и того же субъекта в динамике и анализировать весь мозг целиком, не выдвигая предварительных гипотез о локализации нейронных субстратов, участвующих в исследуемом процессе.

Специалистам, которые впервые используют данный метод, может быть трудно, поскольку применение функциональной МРТ у птиц существенно отличается и является гораздо более сложной задачей, чем использование этого же метода у людей или грызунов. Это обусловлено не только малым размером мозга исследуемых субъектов, но и тем, что их череп состоит из многочисленных воздушных полостей, которые вызывают артефакты магнитной восприимчивости; используя последовательность спинового эха, которая менее подвержена этим артефактам по сравнению с градиентной последовательностью, мы можем проводить функциональную визуализацию всего мозга певчей птицы с очень высокой пространственной специфичностью. Апертура сканера представляет собой замкнутое пространство, которое может искажать слуховые стимулы.

Таким образом, чтобы начать подготовку к данному протоколу, запишите звуковые стимулы при их воспроизведении внутри апертуры системы МРТ семь Тесла с помощью оптоволоконного микрофона и определите наличие искажений для используемой системы МРТ. Здесь мы видим усиленные и подавленные частоты, что показано на записях белого шума, сделанных вне сканера и в месте расположения головы птицы внутри апертуры магнита. Чтобы компенсировать это искусственное усиление, примените функцию эквалайзера к каждому стимулу с помощью программного обеспечения WaveLab для данной конфигурации.

В данном протоколе функция представляет собой гауссово ядро с параметрами, отображенными на экране. Здесь звуковые стимулы должны состоять из нескольких отдельных песенных мотивов конкретной птицы, перемежающихся периодами тишины; отрегулируйте длительность этих периодов тишины так, чтобы общее количество звука и тишины было одинаковым для всех стимулов. Общая продолжительность каждого стимула составляет 16 секунд, что соответствует времени получения двух fMRI-изображений.

Используя программу для предварительной подготовки, нормализуйте интенсивность каждой песни по среднеквадратичному значению (RMS) и примените фильтр высоких частот с частотой среза 400 hertz перед объединением в общий стимульный материал. Эксперимент может быть спроектирован с помощью программного обеспечения для презентации с использованием блочного дизайна «включение-выключение», при котором периоды слуховой стимуляции чередуются с периодами покоя. Каждый блок должен длиться 16 секунд, что соответствует времени получения двух изображений; предъявите каждый тип стимула 25 раз, чтобы в итоге получить 50 изображений для каждого стимула и каждого испытуемого.

Порядок предъявления условий должен быть рандомизирован как внутри каждого испытуемого, так и между испытуемыми. Также настройте экспериментальную парадигму таким образом, чтобы она принимала триггеры от сканера. Это гарантирует, что при каждом повторении в рамках последовательности ФМРТ программное обеспечение сканера будет отправлять триггер в программу аудиторного предъявления, которая, в свою очередь, зарегистрирует номер сканирования и выполнит соответствующую команду.

Здесь представлен протокол, специально адаптированный для использования взрослых зебровых амадин. Зебровые амадины должны содержаться в вольерах при 12-часовом световом и 12-часовом темном фотопериоде, имея свободный доступ к корму и воде на протяжении всего исследования. Минимальное количество особей на один эксперимент составляет 15.

Это число учитывает чувствительность фМРТ со спиновым эхом и естественную межиндивидуальную вариабельность биологических явлений, измеряемых в эксперименте. Для подготовки к эксперименту сначала подсоедините маску для клюва к устройству управления подачей газа с помощью пластиковых трубок и установите её на стол МРТ-системы с индукцией 7 T. Откройте баллоны с кислородом и азотом, а затем включите устройство управления подачей газа.

Также включите систему с обратной связью и устройство для подачи теплого воздуха. Затем проведите анестезию зебра-ненилицы, используя 3% изофлурана в смеси кислорода и азота: поместите клюв птицы в маску и удерживайте голову до полного наступления анестезии. Это можно проверить, осторожно потянув за лапку.

При полной седации птица перестанет втягивать лапу. Кроме того, глаза птицы будут закрыты. Введите клоакальный температурный датчик для контроля температуры тела на протяжении всего эксперимента и поместите пневматический датчик под живот для мониторинга частоты дыхания.

Затем наденьте жилет, чтобы зафиксировать тело птицы на протяжении всего эксперимента. Поддерживайте частоту дыхания в диапазоне от 40 до 100 вдохов в минуту и сохраняйте температуру тела постоянной на уровне 40 градусов. Если частота дыхания слишком низкая или высокая, соответствующим образом отрегулируйте уровень анестезии.

Если проблема не будет устранена, эксперимент следует прекратить, а животное удалить из установки. Для восстановления состояния расположите немагнитные динамики по обе стороны головы зебровой амадиньи и подключите их к усилителю. Убедитесь, что провода динамиков отведены от температурного датчика, так как это может повлиять на показания температуры.

Если расстояние слишком мало, поместите поверхностную РЧ-катушку на голову зебровой амадины. Затем расположите птицу в центре магнита. В завершение, перед началом сканирования, снизьте уровень анестезии до 1.5% ISO фтора.

Для начала сканирования сначала определите положение головного мозга в магните. Получите по одному набору однослойных градиентных эхо-скаут-изображений в сагиттальной, горизонтальной и корональной плоскостях, а также многослойные скаут-изображения, которые будут использоваться в дальнейшем для позиционирования функциональных сканов. Затем снизьте уровень шума градиентов, увеличив время нарастания до 1000 microseconds.

Затем подготовьте последовательность быстрого сбора данных с усилением релаксации, также известную как RARE T2-взвешенная фМРТ. Назначьте 15 сагиттальных срезов, охватывающих почти весь мозг. Теперь выберите аудиторный протокол в программном обеспечении для предъявления стимулов, чтобы гарантировать, что программа не пропустит ни одного триггера от сканера.

Сначала запустите слуховой протокол. После полной загрузки протокола запустите последовательность ФМРТ. Каждому эксперименту ФМРТ должно предшествовать получение 10 тестовых (dummy) изображений, чтобы сигнал достиг стационарного состояния перед началом слуховой стимуляции.

После завершения сбора данных дополните массив до размера 64 × 64. Чтобы определить качество данных, предварительно ознакомьтесь с результатами, используя функциональный инструмент.

В программном обеспечении ParaVision рассчитайте разностный BOLD-ответ между всеми блоками стимуляции и базовым уровнем. Если в первичных слуховых областях активация не наблюдается, вероятно, птица не слышала или не обрабатывала слуховые стимулы из-за технических проблем или уровня анестезии. В таком случае следует проверить настройки и повторить измерение.

После получения функциональных данных выполните анатомическую 3D Т2-взвешенную последовательность в той же ориентации, что и предыдущие сканирования фМРТ. Затем выполните заполнение нулями (zero-filling) этих данных до размера 256 × 256 × 256.

Наконец, снимите зебровую амадину с платформы МРТ и дайте ей восстановиться после наркоза в клетке под греющей лампой. Обычно выход зебровой амадины из наркоза с использованием изофлурана занимает менее пяти минут. Всего через несколько минут птица попытается встать; как только птица полностью восстановится, она пересядет на жердочку, перестав сидеть на дне клетки, после чего можно приступать к обработке данных.

Сначала преобразуйте данные МРТ в формат analyze или nifty. Затем, перед началом обработки данных в SPM, необходимо адаптировать данные фМРТ певчих птиц, увеличив размер вокселя в 10 раз. Поскольку программное обеспечение для анализа фМРТ было разработано для обработки данных фМРТ человека, самым простым способом будет искусственное увеличение размера вокселя данных фМРТ птиц с помощью программного обеспечения MRI Crow.

Обратите внимание, что данная корректировка не влияет на сами данные. Ресемплирование или любые другие модификации данных не применяются. Далее следует предварительная обработка полученных данных.

С помощью SPM 8 сначала выполните перераспределение (realignment) данных FMRI и проведите корегистрацию анатомического 3D-набора данных с временным рядом FMRI. Затем нормализуйте 3D-данные и корегистрированный временной ряд FMRI в соответствии с атласом МРТ мозга зебрового амадина.

Примените матрицу преобразования к набору данных ФМРТ и сгладьте данные с использованием гауссова ядра с параметром 0,5 миллиметра. Затем проведите статистический воксельный анализ в SPM eight, сначала на уровне отдельных птиц, а затем на групповом уровне. Наконец, для визуализации результатов и локализации функциональных активаций спроецируйте статистическую параметрическую карту на атлас зебра-финка — трехмерный атлас мозга зебра-финка высокого разрешения; стереотаксические координаты, использованные в описанном анализе результатов ФМРТ зебра-финка, были разработаны для данного эксперимента в лаборатории биовизуализации (Bioimaging lab), набор данных MRI Atlas.

Контуры мозга и контуры ядер свободно доступны на веб-сайте, ссылка на который приведена здесь. Здесь представлен вид сбоку 3D-модели левого полушария с контурами структур из атласа, проецируемыми на его среднесагиттальный срез. Здесь приведен пример BOLD-ответа фМРТ в первичной слуховой области (поле L) и прилегающих вторичных слуховых областях, вызванных различными слуховыми стимулами по сравнению с состоянием покоя.

Значения T закодированы цветом в соответствии со шкалой, представленной на рисунке; отображены только те воксели, в которых T-критерий оказался значимым. Это еще один пример эксперимента ФМРТ на зебровых амадинах. На изображениях показаны селективные ответы на собственную песню птицы в областях мозга XMLD и HVC.

Числа под изображениями указывают координаты в миллиметрах относительно средней линии. Положительный знак означает, что срезы и статистические результаты относятся к правому полушарию. Протокол, описанный в данном видео, может быть легко адаптирован для применения у других певчих птиц, например, у скворцов.

Это пример результатов такого эксперимента фМРТ. На рисунке показаны активации, вызванные слуховыми стимулами по сравнению с состоянием покоя у одного и того же скворца в разные сезоны. Внедрение и оптимизация функциональной МРТ для певчих птиц открывают новые возможности для исследований в этой области.

Уже было показано, что данный метод является ценным инструментом для экспериментального анализа сложных сенсомоторных и когнитивных процессов, лежащих в основе вокальной коммуникации у этих моделей животных. Кроме того, благодаря своей неинвазивности и подходу, охватывающему весь мозг, fMRI может быть использована в качестве дополнительного метода для уточнения результатов более распространенных локальных и инвазивных методов. Растущее число экспериментов fMRI на SUNBIRDS демонстрирует применимость данного метода для решения когнитивных исследовательских задач; в будущем следует приложить усилия для дальнейшего расширения области применения МРТ за пределы анализа слухового восприятия, которое остается активным даже под воздействием анестезии, за счет использования бодрствующих субъектов, приученных к протоколу визуализации.

Это может открыть новые возможности для исследований, в которых птицы смогут активно участвовать в экспериментах по ЭМВ, а их внимание будет контролироваться экспериментально.