Хирургические процедуры для крысиной модели частичного ортотопической трансплантации печени с печеночной артериальной реконструкции

Общая цель данной процедуры заключается в выполнении частичной ортотопической трансплантации печени у крыс в качестве воспроизводимой экспериментальной модели для исследований в области трансплантации. Это достигается путем первоначального извлечения печени из донорской крысы. Вторым этапом является подготовка трансплантата печени ex vivo, включая резекцию 50% печени.

Далее удаляют собственную печень крысы-реципиента. Заключительным этапом является имплантация частичного трансплантата печени реципиенту. В конечном итоге измеряют уровни сывороточного аланинаминотрансферазы для оценки степени повреждения гепатоцитов трансплантата печени после трансплантации.

Как правило, лица, впервые выполняющие данную процедуру, сталкиваются с трудностями из-за сложности этапов, требующих продвинутых навыков микрохирургии. Для начала процедуры поместите наркотизированную крысу-донора на грелку; убедившись с помощью щипка за пальце, что животное находится в состоянии глубокого наркоза, зафиксируйте передние конечности с помощью магнитной системы ретракции. Выбрейте шерсть со всей области живота крысы и стерилизуйте соответствующий участок кожи раствором повидон-йода.

Вскройте брюшную полость путем срединного разреза с двусторонним расширением. Поместите шприц объемом 5 мл под спину крысы так, чтобы верхняя полая вена в области печени была приподнята вентрально с помощью зажима типа «москит»; потяните шприц в сторону головы и установите подреберные ретракторы для расширения операционного поля. В связи с необходимостью частого перемещения ретракторов и шприца объемом 5 мл в ходе процедуры, вокруг разреза хирургические салфетки не используются. Работая под хирургическим микроскопом с 16-кратным увеличением, препарируйте серповидную и левую треугольную связки, перевяжите и пересеките левую диафрагмальную вену, затем отодвиньте срединную и левую латеральную доли печени вверх с помощью влажного марлевого тампона.

С помощью биполярного пинцета коагулируйте и пересеките параэзофагеальные сосуды между левой латеральной и передней координатной долями. Выведите кишечник за пределы брюшной полости на левую сторону крысы и накройте его влажной марлевой салфеткой. Влажной марлевой салфеткой отведите правую латеральную долю вверх.

Отделите подпеченочный отдел нижней полой вены от забрюшинной клетчатки и перевяжите правую надпочечниковую вену, которую разделят позже, непосредственно перед извлечением трансплантата, для установки стента в желчный проток; сначала перевяжите желчный проток на уровне ветвления гастродуоденальной артерии. Сделайте небольшой разрез в передней стенке желчного протока проксимальнее места перевязки, затем, удерживая переднюю стенку разреза прямым микропинцетом в левой руке, с помощью изогнутого микропинцета в правой руке введите стент в проток. Зафиксируйте его шелковой нитью 6-0.

Оставьте один из обрезанных концов нити на желчном протоке длиной 4 мм, чтобы нить можно было удерживать во время последующего анастомоза. Освободите воротную вену от верхних брыжеечных и селезеночной вен, перевязав и пересекв их; перевяжите и пересеките гастродуоденальную артерию. Затем изолируйте общую печеночную артерию от головки поджелудочной железы до ее основания.

Поверните печень вправо с помощью ватных тампонов и рассеките связку вокруг задней поверхности печени и пищевода по завершении подготовки к иссечению печени. Удалите ретракторы, кровоостанавливающие зажимы из отростка xiphoid process и шприц объемом 5 mL из-под спины крысы.

Верните кишечник в брюшную полость. Введите 500 IU гепарина натрия в двух миллилитрах физиологического раствора через вену полового члена. Примерно через три минуты, убрав пятимиллилитровый шприц, москитные зажимы и ретрактор, перевяжите общую печеночную артерию проксимальнее ее основания.

Оставьте один из обрезанных концов нити перевязанным для общей печеночной артерии. Спустя значительное время после зажима нижней полой вены в подпеченочном сегменте перевяжите её рядом с правой почечной веной с помощью зажима-москита.

Зажмите воротную вену одноразовым микрососудистым зажимом ниже культи селезеночной вены. Разрежьте переднюю стенку воротной вены и введите в нее катетер 18-го калибра. Проведите перфузию печени in situ 60 миллилитрами холодного гистидин-триптофан-кетоглутаратного раствора.

При гидростатическом давлении 20 сантиметров сделайте надрез диафрагмы, внутригрудной полой вены и передней стенки подпеченочного отдела полой вены, чтобы обеспечить вымывание перфузионного раствора из печени. Зажмите подпеченочный отдел полой вены микрососудистым зажимом непосредственно под печенью. Извлеките печень, пересекая подпеченочный отдел полой вены.

Воротная вена, диафрагма, остальные связки, правая надпочечниковая вена и общая печеночная артерия. Поместите иссеченную печень в холодный раствор HTK в металлической чаше, установленной в пластиковом контейнере с дробленым льдом. Манипуляции с трансплантатом печени выполняются в металлической чаше, заполненной ледяным раствором HTK; для прикрепления манжеты к воротной вене зажмите ствол воротной вены бульдог-зажимом DeBakey и зафиксируйте зажим в перекидном положении над чашей.

Пропустите воротную вену через манжету и снова зажмите воротную вену вместе с удлинителем манжеты в положении «на 12 часов», натяните стенку воротной вены поверх манжеты так, чтобы культя селезеночной вены находилась за пределами манжеты в положении «на 7 часов», и зафиксируйте воротную вену шелковой нитью 6-0 для введения стента в печеночную артерию. Зафиксируйте печень, зажав оба края диафрагмы пинцетом, и выпрямите общую печеночную артерию, удерживая перевязанную нить булдог-зажимом DeBakey и прямыми микроножницами. Левой рукой сделайте небольшой разрез в передней стенке общей печеночной артерии.

Зафиксируйте переднюю стенку разреза прямым микропинцетом и правой рукой введите стент в общую печеночную артерию. С помощью изогнутого микропинцета закрепите стент шелковой нитью 6-0, оставив один из обрезанных концов нити длиной 4 мм. Промойте печень через артериальный катетер 5 мл холодного раствора HTK для резекции 50% печени.

Сначала зажмите заднюю координатную долю москитным зажимом для её фиксации. Затем перевяжите её ножку шелковой нитью 4-0 и резектируйте долю.

Переднюю часть коратной доли удаляют аналогичным образом. Затем поверните пластиковый контейнер на 90 градусов. Зажмите правый край диафрагмы и левую часть срединной доли.

Сделайте небольшой разрез по верхнему краю границы билатеральных отделов медиальной доли, затем после лигирования удалите левый отдел. После лигирования ножки нитью из шелка 4-0 удалите левую латеральную долю и осторожно прижгите резецированную поверхность печени биполярным пинцетом. Таким образом, объем печени уменьшается примерно на 50% для проведения пластики верхней полой вены.

Сначала зафиксируйте положение печени, зажав оба края диафрагмы москитным зажимом. Затем подрежьте переднюю стенку супрагепатической полой вены, удалив соответствующий участок диафрагмы. С внешней стороны на оба угла наложите удерживающие швы полипропиленовой нитью 2 7 0 для последующего анастомоза.

После этого подрежьте заднюю стенку супрагепатической нижней полой вены. Храните трансплантат печени при температуре 4 °C в растворе HTK в охлаждающей водяной бане. Подготовьте реципиента к операции аналогично подготовке донора и вскройте брюшную полость срезом по средней линии.

Поместите влажный марлевый тампон на правую сторону двенадцатиперстной кишки и всех отделов кишечника. Чтобы сформировать операционное поле вокруг подпеченочного отрезка нижней полой вены, переместите левую латеральную и срединную доли в левое поддиафрагмальное пространство, а правую латеральную долю отодвиньте вверх с помощью влажного марлевого тампона.

Изолируйте подпеченочный отдел нижней полой вены от забрюшинной клетчатки, перевяжите и пересеките правую надпочечниковую вену, используя влажную марлю и ватные тампоны. Поверните печень влево и рассеките связки вокруг задней поверхности печени. Пересеките желчный проток чуть ниже места отхождения ветви из доли хвоста.

Оставьте один из обрезанных концов нити перевязанным для желчного протока длиной 4 мм. Перевяжите и пересеките гастродуоденальную артерию и собственную печеночную артерию на расстоянии 3 мм от места их отхождения от общей печеночной артерии, чтобы создать широкий конец общей печеночной артерии. Зажмите инфрапеченочный отдел нижней полой вены металлическим микрососудистым зажимом чуть выше правой почечной вены, а воротную вену — на уровне ее бифуркации в воротах печени с помощью зажима типа «москит». Зажмите супрапеченочный отдел нижней полой вены вместе с диафрагмой периферическим сосудистым зажимом и зафиксируйте зажим в комке жировой глины. Снизьте концентрацию изофлурана для поддержания анестезии до 0,4 об. %. Удалите нативную печень реципиента, рассекая супрапеченочную нижнюю полую вену на границе между ней и печенью.

Воротную вену чуть выше зажима москитных щипцов и нижнюю полую вену немного ниже средней точки между печенью и правой почечной веной. Поместите трансплантат печени ортотопически. Реконструкция сосудов является самой сложной и важной частью данной процедуры.

Эту процедуру необходимо выполнять очень осторожно, но быстро. Для выполнения анастомоза верхней полой вены над печенью непрерывным швом наложите удерживающий шов на верхнюю полую вену реципиента изнутри наружу, используя прилагаемую полипропиленовую нить 7-0, в правом углу трансплантата, после чего завяжите узел аналогичным образом. Наложите второй удерживающий шов в левом углу.

Это будет первый стежок непрерывного шва. Чтобы расширить анастомоз, зажмите и удерживайте швы с помощью зажимов типа «бульдог» DeBakey за оба угла, осторожно потянув их латерально вверх. Затем проколите стенку со стороны трансплантата в левом углу, двигаясь снаружи внутрь, максимально близко к наружному узлу, и наложите семь-восемь стежков по заднему ряду внутри просвета satic vena caver в направлении правого угла.

Выполните первые несколько стежков осторожно, чтобы внутренние просветы были направлены друг к другу в правильном углу. Проведите полипропиленовую нить размера 7-0 сквозь сосуд со стороны транспланта наружу. Наложите передний ряд швов снаружи справа налево, используя примерно 10 стежков.

Промойте внутреннюю полость раствором Рингера-лактата. Чтобы удалить пузырьки воздуха, наложите последний шов рядом с удерживающим швом, а затем завяжите их вместе. Для реконструкции воротной вены зажмите её микрососудистым зажимом и зафиксируйте зажим-москит в пластилине. Затем надрежьте переднюю стенку воротной вены непосредственно под браншами зажима-москита.

Промойте внутреннюю поверхность реципиентной воротной вены и манжету раствором Рингера-лактата. Введите манжету в воротную вену и зафиксируйте ее циркулярным швом шелковой нитью 6-0. В завершение проведите реперфузию печени.

Извлеките шприц объемом 5 мл из спинной части крысы и увеличьте концентрацию изофлурана до 0,8 объемного процента для реконструкции печени методом стентирования. Сначала зажмите нить собственной печеночной артерии москитными зажимами и зафиксируйте ее в глине. Затем пережмите общую печеночную артерию реципиента.

Сделайте небольшой разрез в месте разветвления Y-образной структуры на конце общей печеночной артерии, чтобы создать отверстие в форме воронки. Удерживайте стент, помещенный в общую печеночную артерию трансплантата, с помощью изогнутого микропинцета. Введите стент в общую печеночную артерию реципиента и зафиксируйте его шелковой нитью 6-0. Свяжите один конец этой нити с четырехмиллиметровой нитью на общей печеночной артерии трансплантата таким образом, чтобы обе общие печеночные артерии располагались ближе друг к другу, что снизит натяжение в области анастомоза.

После этого снимите зажим с нижней полой вены для выполнения анастомоза непрерывным швом аналогично анастомозу верхней полой вены, но используйте большее количество стежков с более мелкими захватами. После снятия зажимов увеличьте концентрацию анестетика до 1,0 объемного процента для реконструкции желчного протока. Зажмите нить желчного протока реципиента москитным зажимом и зафиксируйте её в глине.

Сделайте небольшой разрез в желчном протоке на соответствующем уровне, чтобы реконструированный желчный проток не оказался слишком длинным. Вставьте стент и зафиксируйте его шелковой нитью 6-0. Завяжите эту нить и нить на трансплантате протока.

На этом все процедуры реконструкции завершены. Зашейте разрез брюшной стенки послойно непрерывным швом с использованием нити Vicryl 4-0. Сразу после операции введите крысе-реципиенту подкожно раствор сферо-натрия и бупренорфина в общем объеме 1,5 milliliters физиологического раствора.

Оставьте крысу восстанавливаться в течение 60 минут в специальной клетке отделения интенсивной терапии с подачей теплого воздуха и кислорода, прежде чем вернуть её в обычную клетку. Все крысы-реципиенты выжили до момента запланированной эвтаназии для забора крови через 1, 3, 24 и 168 часов после портальной реперфузии. В образцах сыворотки анализировали уровень аланинаминотрансферазы, который отражает степень гепатоцеллюлярного повреждения трансплантатов печени после трансплантации.

Как показано на этом графике, уровни ALT достигли пика через 24 часа, а затем снизились до нормальных значений к 168 часам. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить частичную топическую трансплантацию печени у крыс в качестве воспроизводимой экспериментальной модели для исследований в области трансплантации.