Массовые цитометрии: Протокол для ежедневного настройка и запуск образцы клеток на Цитометр массовой CyTOF

Целью капитального ремонта этой процедуры является демонстрация правильной ежедневной настройки и анализа образцов на приборе CyTOF. Сначала машина собирается и включается. Далее настройки прибора оптимизируются для настройки на максимальный сигнал.

После этого машина готова к обработке образцов. На последнем этапе машина очищается и выключается. В конечном счете, оптимальные данные ячейки могут быть получены в соответствии с конкретными временными требованиями.

Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение. Ежедневные процедуры настройки, настройки и очистки трудно изучить из руководства. Поскольку требуется несколько одновременных этапов программного обеспечения.

Вам необходимо набраться опыта, чтобы получить представление о соответствующих уровнях фона и интенсивности сигнала не менее чем за 15 минут до начала эксперимента. Откройте программу CyTOF и выберите «Настройка прибора». Затем на вкладке «Каркас для карт» нажмите кнопку «Нагреватель вкл.», чтобы температура оболочки распылительной камеры достигла 200 градусов Цельсия.

Замените шприц в шприцевом насосе на свежий шприц, наполненный водой в милликубах. Затем очистите небулайзер, дважды промыв 5%-ным цитроном через отверстие. Чтобы удалить остатки цитрона, повторите обратную промывку водой Milli Q.

Затем откройте клапан баллона с аргоном, в результате чего на передней части машины загорится Аргоннский свет. Затем подсоедините небулайзер к входу подпиточного газа и прикрепите небулайзер к трубке для введения жидкости. Вставьте конец небулайзера в белое отверстие в нагревательной оболочке на вкладке RFG-контроллера в окне настройки прибора.

Нажмите «Запустить плазму», затем нажмите «ОК». После завершения запуска нажмите «ОК» еще раз во всплывающем окне. Теперь включите шприцевую помпу.

При заправке шприца нажмите кнопку «стоп», а не кнопку паузы, чтобы сбросить счетчик громкости Перед калибровкой масс-цитометра убедитесь, что он прогрелся за 20 минут. После того как аппарат стабилизируется, нажмите кнопку настроек сбора данных, чтобы открыть окно настроек сбора данных. Во вкладке аналиты.

Нажмите на периодическую таблицу, чтобы открыть панель выбора изотопов. Затем выберите изотопы в решении для настройки DVS sciences, перечисленные в руководстве, и нажмите «Сохранить». Затем нажмите кнопку «Изотопы на чтение», чтобы открыть окно «Масса на чтение».

Выберите количество импульсов и измените масштаб оси Y, введя новое число и нажав клавишу Enter. Теперь наполните зеленую норму на один миллилитр и введите шприц раствором для настройки. Поверните селектор порта образца в положение загрузки.

Введите 450 микролитров раствора для настройки, а затем поверните селектор для инъекции. Подождите, пока изотопы раствора для настройки начнут отображаться в виде полос на этом дисплее. Сигналы во времени полета в диапазоне от 9,400 до 9,800 обусловлены изотопами ксенона в газообразном аргоне.

Теперь вернитесь к массам по окну чтения и нажмите зеленую кнопку воспроизведения. Каждая цветная линия представляет выбранные изотопы с вкладки «Аналиты». Когда уровни изотопов стабильны, настройте текущий выбранный ток из выпадающего меню на вкладке параметров в окне настроек сбора данных.

В стартовом окне введите ноль для финиша, введите 10. В качестве значения шага введите 0,5, а в качестве времени установления введите 200. Затем нажмите «Сохранить».

Затем нажмите на окно чтения и нажмите «Воспроизвести». Отметив, где сигналы изотопов достигают пика, перейдите на вкладку «Настройка канала ЦАП» в окне настройки прибора. Прокрутите вниз до текущего значения и введите пиковое значение изотопа.

Нажмите «Установить фактическое текущее значение», а затем сохраните. Далее измените выпадающее меню, чтобы восполнить газ. Введите 0.55 в начальном окне, 0.95 в конечном окне, 0.05 в окне значений шага и 200 в окне времени расчета.

Нажмите «Сохранить». После возврата к массам в окне чтения и повторного нажатия кнопки воспроизведения, ось x теперь будет отображать расход подпиточного газа. Обратите внимание на значения, на которых сигналы изотопов достигают пика, и обратите внимание на быстрое увеличение сигнала GD 1 55 ближе к концу.

Затем вернитесь на вкладку Настройка канала ЦАП. Прокрутите вниз до раздела Подпитка, газ и введите новое пиковое значение изотопа. Нажмите «Установить фактическое текущее значение».

Затем нажмите «Сохранить» еще раз, чтобы записать соотношение желаемого изотопа и оксида. Сначала сделайте второй впрыск 450 микролитров раствора для тюнинга. Затем на вкладке параметров выберите время из выпадающего меню и введите ноль в начальном окне, 10 в конечном окне, единицу в окне значения шага и 200 в окне расчета.

После нажатия кнопки воспроизведения в окне массового чтения используйте курсор для считывания старшего значения TM 1 69 или TB 1 59, а также значения GD 1 55. Теперь введите три миллилитра воды Milli Q через контур образца, а затем 500 микролитров промывочного раствора DVS. На вкладке калибровки массы нажмите кнопку «Выполнить», чтобы отслеживать ход промывки при очистке до тех пор, пока интенсивность разводов не начнет уменьшаться.

Затем добавьте три миллилитра воды в милликубе и наблюдайте, пока полосы не снизятся до фонового уровня. Начните с ввода образцов изотопов, только что продемонстрированных для изотопов настроечного раствора, а затем нажмите кнопку «Сохранить». Затем откройте окно сбора данных и при необходимости измените параметры сбора данных для объема выборки.

Например, образец объемом 450 микролитров заполнит контур выборки и займет 600 секунд, чтобы учесть задержки в сборе данных клетки. Перед запуском установите задержку сбора данных не менее 30 секунд, а задержку стабилизации детектора — не менее 20 секунд. Промойте образцы клеток не менее двух раз водой в милликубах, а затем повторно суспендируйте образец в максимальном соотношении от 10 до шести клеток на миллилитр и отфильтруйте полученный клеточный раствор через сетчатое фильтр для клеток с плотностью 35 микрометров.

Для удаления любых заполнителей. Теперь введите новое имя файла для текущего образца. Обратите внимание, что все файлы должны быть сохранены на диске E.

Затем переключите клапан контура отбора проб в положение загрузки, введите образец, переключите клапан контура отбора проб обратно в положение ввода, а затем нажмите кнопку «Выполнить». В окне получения. Ячейки будут представлены в окне снимка в виде горизонтальных наборов меток в каждом вертикальном изотопном канале и будут демонстрировать наилучшее разрешение от 300 до 500 клеток в секунду, как показано здесь.

Когда сбор данных по образцу будет завершен, появится всплывающее окно. Нажмите кнопку «ОК», чтобы подтвердить завершение прогона пробы, а затем введите не менее 500 микролитров воды MQ между каждым образцом, чтобы свести к минимуму перенос проб для очистки машины После использования введите 450 микролитров промывочного раствора в контур отбора проб. Следите за выделением свободного металла, а затем промойте контур образца тремя миллилитрами воды milli Q, контролируя промывку до тех пор, пока не будут достигнуты уровни фоновых полос.

Затем, чтобы выключить машину, выберите вкладку RFG-контроллер в окне настройки прибора и нажмите кнопку Остановить плазму. Когда процедура будет завершена, нажмите кнопку «ОК» во всплывающем окне, порекомендовав удалить небулайзер на вкладке «Каркас для карт». Выключите нагреватель, закройте вентиль на подаче аргонны, а затем осторожно потяните назад за небулайзер, чтобы извлечь его из распылительной камеры.

Затем открутите трубку для введения образца и отложите ее в сторону. Открутите штуцер для ввода подпиточного газа до тех пор, пока он немного ослабнет, а затем снимите небулайзер. Наконец, используя тот же шприц и трубку, что и продемонстрированные ранее, очистите оба порта небулайзера 5% цитроном и храните небулайзер, покрытый 5% цитроном, до следующего использования.

Надлежащая промывка цитометра массы водой UE и раствором промывки DVS снизит уровни поглощения металла трубками и другими частями машины, помогая уменьшить любой фон, как видно на этих графиках. Неправильная настройка, представленная пурпурной линией, значительно увеличивала образование оксидов при m плюс 16 по сравнению с правильно настроенным образцом, о чем свидетельствует темно-синяя линия. Это приводит к незначительному уменьшению количества полезных сигналов при m и значительному увеличению нежелательных фоновых помех при m плюс 16.

Правильная промывка и правильное разбавление образцов в воде Milli Q обеспечит минимальный фон и максимальное разрешение клеток, уравновешивая при этом потребность в скорости. Аналогично данным репрезентативного эксперимента, показанного здесь в этом эксперименте, гранулы полистирола, содержащие природное содержание лантан 1 39 ODIUM 1 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 и LUTETIUM 1 75, были запущены в режиме захвата клеток. Данные были проанализированы с помощью FlowJo, и мусор от сломанных бусин был удален

Было определено, что правильно настроенная проба имеет скорость потока 0,74 литра в минуту, как показано темно-синей линией. При этой скорости потока наблюдались более высокие интенсивности сигнала, чем при более низких скоростях потока, и было замечено, что этот правильно настроенный образец имеет более высокий сигнал при массах металла M и меньший сигнал при массах M плюс 16 оксидов, чем неправильно настроенные сигналы. На снимке показан сигнал крупным планом в точках массы M LANTHANUM 1 39 и THULIUM 1 69.

Следует отметить, что расход подпиточного газа влияет на интенсивность сигнала LANTHANUM 1 39 больше, чем интенсивность сигнала thulium 1 69. На этих графиках показан сигнал при массах m плюс 16 оксидов 1 55 и 180 5, соответствующих оксидам LANTHANUM 1 39 плюс oh 16 и тулию 1 69 плюс oh 16 соответственно. Следует отметить, что скорость потока подпиточного газа увеличивает массу сигнала 155 гораздо больше, чем масса 1805 сигнала, так как лантан 1 39 легче окисляется, чем тулий 1 69.

Здесь изображены интенсивности сигнала m и m плюс 16 в зависимости от расхода подпиточного газа. Заполненные значки представляют массу M. В то время как открытые значки представляют массу M плюс 16, цвета линий соответствуют соответствующей массе M. Обратите внимание, что интенсивность сигнала LANTHANUM 1 39 и цена ODIUM 1 41 сильно зависят от расхода подпиточного газа. Даже достижение точки, где масса m плюс оксид 16 присутствует, чем масса M. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как правильно запустить CyTOF, настроить его, затем запустить свои образцы и, наконец, правильно очистить и выключить машину в конце ваших ежедневных запусков.