Массовые цитометрии: Протокол для ежедневного настройка и запуск образцы клеток на Цитометр массовой CyTOF

Основная цель данной процедуры — продемонстрировать правильную ежедневную настройку и анализ образцов на приборе CyTOF. Сначала осуществляется сборка и включение прибора. Затем параметры прибора оптимизируются для достижения максимального сигнала при настройке.

После этого прибор готов к анализу образцов. На заключительном этапе проводится очистка и выключение прибора. В конечном итоге можно получить оптимальные данные о клетках в соответствии с конкретными временными требованиями.

Визуальная демонстрация данной методики имеет решающее значение. Процедуры ежедневной настройки, калибровки и очистки сложно освоить по руководству, так как они включают несколько одновременных этапов работы с программным обеспечением.

Вам необходимо набраться опыта, чтобы почувствовать подходящие уровни фона и интенсивность сигнала. По крайней мере за 15 минут до начала эксперимента откройте программное обеспечение CyTOF и выберите настройку прибора (instrument setup). Затем на вкладке корзины с картами (card cage) нажмите кнопку включения нагревателя (heater on), чтобы кожух распылительной камеры нагрелся до 200 °C.

Замените шприц в шприцевом насосе на новый шприц, заполненный водой Milli-Q. Затем очистите небулайзер, выполнив обратную промывку 5% раствором Citron дважды через каждый порт. Чтобы удалить остатки Citron, повторите обратную промывку водой Milli-Q.

Затем откройте вентиль баллона с аргоном, после чего на передней панели прибора загорится индикатор Argonne. Затем подсоедините распылитель к входу вспомогательного газа и к трубке подачи жидкости. Вставьте конец распылителя в белое отверстие нагревательного кожуха на вкладке RFG контроллера в окне настройки прибора.

Нажмите «start plasma», затем нажмите «okay». После завершения запуска снова нажмите «okay» в появившемся окне. Теперь включите шприцевой насос.

При повторном наполнении шприца нажимайте кнопку остановки (stop), а не кнопку паузы (pause), чтобы сбросить счетчик объема. Перед калибровкой масс-цитометра убедитесь, что прибор прогревался в течение 20 минут. После стабилизации работы прибора нажмите кнопку настроек сбора данных (acquisition settings), чтобы открыть окно настроек сбора данных. Перейдите на вкладку аналитов (analytes).

Нажмите на периодическую таблицу, чтобы открыть панель выбора изотопов. Затем выберите изотопы, входящие в состав калибровочного раствора DVS sciences, указанные в руководстве, и нажмите «сохранить». После этого нажмите кнопку «изотопов за одно считывание», чтобы открыть окно масс за одно считывание.

Выберите количество импульсов и измените масштаб оси y, введя новое число и нажав клавишу enter. Теперь заполните зеленый одномиллилитровый шприц для стандартной инжекции калибровочным раствором. Поверните селектор порта пробы в положение load.

Введите 450 µL калибровочного раствора, затем поверните селектор в положение ввода. Дождитесь, пока изотопы калибровочного раствора начнут появляться в виде полос на этом дисплее. Сигналы в области времени пролета от 9,400 до 9,800 обусловлены изотопами ксенона в аргоновом газе.

Теперь вернитесь к окну масс по окну считывания и нажмите зеленую кнопку воспроизведения. Каждая цветная линия представляет выбранные изотопы из вкладки аналитов. Когда уровни изотопов стабилизируются, настройте ток селекции, выбрав соответствующее значение из выпадающего меню на вкладке параметров в окне настроек сбора данных.

В окне начальных настроек введите 0 для параметра finish и 10 для параметра start. Для значения шага (step value) введите 0,5, а для времени установления (settling time) — 200. Затем нажмите кнопку save.

Затем снова перейдите в окно масс для каждого измерения и нажмите кнопку воспроизведения. Зафиксировав положение пиков сигналов изотопов, перейдите на вкладку настройки каналов ЦАП в окне конфигурации прибора. Прокрутите вниз до раздела тока и введите значение пика изотопа.

Нажмите «set actual current value», затем «save». Далее в выпадающем меню выберите «make up gas». Введите 0.55 в окне «start», 0.95 в окне «end», 0.05 в окне «step value» и 200 в окне «settling time».

Нажмите «Сохранить». После возврата к окну показаний масс и повторного нажатия кнопки «Воспроизвести» на оси x будет отображаться скорость потока газа подпитки. Обратите внимание на значения, при которых достигаются пики сигналов изотопов, и отметьте резкий рост сигнала GD 1 55 ближе к концу записи.

Затем вернитесь на вкладку настройки канала DAC. Прокрутите вниз до раздела makeup, gas, и введите новое значение пика изотопа. Нажмите set actual current value.

Затем снова нажмите «save», чтобы записать соотношение искомого изотопа и оксида. Сначала выполните вторую инъекцию настроечного раствора объемом 450 microliter. Затем на вкладке параметров выберите «time» в выпадающем меню и введите 0 в окне «start», 10 в окне «end», 1 в окне «step value» и 200 в окне «settling».

После нажатия кнопки воспроизведения в окне масс на одно считывание используйте курсор, чтобы считать более высокое значение для TM 1 69 или TB 1 59, а также значение GD 1 55. Теперь введите три миллилитра воды Milli Q через петлю для образца, а затем 500 µL промывочного раствора DVS. На вкладке калибровки масс нажмите «запуск», чтобы контролировать процесс очищающей промывки до тех пор, пока интенсивность полос не начнет снижаться.

Затем добавьте три миллилитра воды из milli-Q и проводите мониторинг до тех пор, пока полосы не снизятся до фоновых уровней. Начните с ввода изотопов образца, продемонстрированных ранее, в поле изотопов калибровочного раствора, после чего нажмите «сохранить». Далее откройте окно сбора данных и измените настройки сбора в соответствии с объемом образца.

Например, образец объемом 450 µL заполнит петлю для образца, и время его прохождения составит 600 с, чтобы компенсировать задержки при сборе данных о клетках. Перед запуском установите задержку сбора данных (acquisition delay) не менее 30 с и задержку стабилизации детектора (detector stability delay) не менее 20 с. Промойте образцы клеток минимум дважды водой milli Q, затем ресуспендируйте образец до максимальной концентрации 10⁶ клеток/мл и профильтруйте полученную клеточную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 35 µm.

Для удаления всех агрегатов. Теперь введите новое имя файла для текущего образца. Обратите внимание, что все файлы должны быть сохранены на диске E.

Затем переключите клапан петли для образца в положение загрузки (load), введите образец, верните клапан петли в положение ввода (inject) и нажмите кнопку «запуск» (run). В окне сбора данных клетки будут отображаться в окне снимка (snapshot window) в виде горизонтальных скоплений отметок в каждом вертикальном изотопном канале; наилучшее разрешение будет достигаться при скорости около 300–500 клеток в секунду, как показано здесь.

По завершении сбора данных образца появится всплывающее окно. Нажмите «ОК», чтобы подтвердить окончание анализа образца, а затем введите по меньшей мере 500 µL воды MQ между каждым образцом, чтобы минимизировать перенос образца и очистить прибор. После использования введите 450 µL промывочного раствора в петлю для образца. Контролируйте высвобождение свободного металла, а затем промойте петлю для образца тремя миллилитрами воды milli Q, продолжая промывку до достижения уровней фоновой линии.

Затем для выключения прибора перейдите на вкладку контроллера RFG в окне настройки инструмента и нажмите «stop plasma». После завершения процедуры нажмите «okay» в появившемся окне, в котором рекомендуется извлечь распылитель с помощью вкладки card cage. Выключите нагреватель, закройте вентиль подачи аргона, после чего осторожно потяните распылитель на себя, чтобы извлечь его из распылительной камеры.

Затем открутите трубку подачи образца и отложите ее в сторону. Открутите соединение подачи вспомогательного газа, пока оно слегка не ослабнет, после чего снимите распылитель. В завершение, используя тот же шприц и трубку, что и в предыдущем примере, промойте оба порта распылителя 5% Citron и храните распылитель, погруженным в 5% Citron, до следующего использования.

Тщательная промывка масс-цитометра деионизированной водой и промывочным раствором DVS снизит уровень абсорбции металлов трубками и другими частями прибора, что поможет уменьшить уровень фонового сигнала, отображенного на данных графиках. Неправильная настройка, представленная пурпурной линией, привела к значительному увеличению образования оксидов при m плюс 16 по сравнению с правильно настроенным образцом, обозначенным темно-синей линией. Это приводит к небольшому снижению интенсивности искомых сигналов при m и значительному усилению нежелательных фоновых помех при m плюс 16.

Правильная промывка и надлежащее разведение образцов в воде Milli Q обеспечат минимальный фон и максимальное разрешение клеток при сохранении необходимой скорости анализа. Аналогично данным репрезентативного эксперимента, представленным здесь, в данном эксперименте в режиме сбора данных о клетках были проанализированы полистирольные гранулы, содержащие природные изотопы лантана 139, неодима 140, тербия 159, эрбия 169 и лютеция 175. Данные были проанализированы с помощью FlowJo, а частицы разрушенных гранул были исключены с помощью гейтирования.

Было определено, что оптимальная настройка образца достигается при скорости потока 0.74 liters per minute, что представлено темно-синей линией. При данной скорости потока наблюдалась более высокая интенсивность сигнала, чем при более низких скоростях; также было отмечено, что при правильной настройке образца сигнал при массах металлов M выше, а при массах оксидов m плюс 16 ниже, чем при неправильной настройке. Здесь показан увеличенный фрагмент сигнала при массах M LANTHANUM 1 39 и THULIUM 1 69.

Обратите внимание, что скорость потока газа-носителя влияет на интенсивность сигнала LANTHANUM 1 39 сильнее, чем на интенсивность сигнала thulium 1 69. На этих графиках показан сигнал при массах оксидов m плюс 16, 1 55 и 180 5, соответствующих оксидам LANTHANUM 1 39 плюс oh 16 и thulium 1 69 плюс oh 16 соответственно. Заметьте, что скорость потока газа-носителя увеличивает сигнал массы 1 55 гораздо сильнее, чем сигнал массы 180 5, так как lanthanum 1 39 окисляется легче, чем thulium 1 69.

Здесь представлены интенсивности сигналов m и m плюс 16 в зависимости от скорости потока подпиточного газа. Закрашенные значки представляют массу M, в то время как незакрашенные значки представляют массу M плюс 16; цвета линий соответствуют соответствующей массе M. Обратите внимание, что на интенсивности сигналов LANTHANUM 1 39 и price ODIUM 1 41 существенно влияет скорость потока подпиточного газа, вплоть до достижения точки, когда количество оксида массы m плюс 16 превышает количество массы M. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как правильно запускать систему CyTOF, настраивать её, проводить анализ ваших образцов и, наконец, правильно очищать и выключать прибор по завершении ежедневных сессий.