Исследования О внесении изменений гиппокампа Функция Circuit после легкой черепно-мозговой травмой

Общая цель следующего эксперимента заключается в исследовании изменений функций нейронных сетей в областях мозга, затронутых экспериментальной моделью легкой черепно-мозговой травмы. Эксперименты начинаются с нанесения мыши латеральной жидкостной перкуссионной травмы, которая имитирует как патологию, так и симптоматику легкой черепно-мозговой травмы у человека. На втором этапе для оценки когнитивных нарушений, вызванных травмой мозга, используется контекстуальная кондиционированная реакция страха — поведение, зависящее от гиппокампа. Далее, для определения регионально-специфических изменений синаптического баланса между возбуждающей и тормозной синаптической передачей используются внеклеточная и внутриклеточная регистрация, а также вольт-чувствительные красители. В исследуемой области, гиппокампе, результаты демонстрируют специфические для отдельных подрегионов изменения чистой синаптической эффективности в гиппокампе, основанные на различиях между контрольной группой и мышами с травмой мозга, выявленных с помощью трех описанных методов регистрации.

Основным преимуществом данного подхода является возможность различать эффекты как патологического состояния, так и потенциальных терапевтических средств на нескольких физиологических уровнях, что позволяет получить более целостную картину дефицитов данной цепи. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о черепно-мозговой травме, например, о том, какие именно нейроны наиболее подвержены повреждению и, следовательно, вносят наибольший вклад в дисфункцию гиппокампа после травмы. Значимость нашего подхода распространяется на лечение черепно-мозговых травм, поскольку он позволяет сначала определить лежащие в основе механизмы, а затем разработать потенциальные методы терапии для восстановления нормальной физиологии в областях, поврежденных в результате травмы мозга.

В данной процедуре проведите анестезию мыши, используя смесь кетамина и ксилазина, вводимую внутрибрюшным путем. Затем выполните С-образную краниектомию над правой теменной областью, используя сверло с внешним диаметром три миллиметра. После этого зафиксируйте разъем иглы Luer-lock над местом С-образного трепанационного отверстия с помощью цианоакрилата и стоматологического акрила.

Через 24 часа проведите анестезию мыши с помощью изофлурана путем ингаляции. После возобновления нормального дыхания, но до того, как мышь станет чувствительной к стимуляции, нанесите 20-миллисекундный импульс физиологического раствора на череп с помощью устройства для нанесения жидкостной перкуссионной травмы. Немедленно удалите коннектор после нанесения травмы. Затем повторно проведите анестезию мыши с помощью изофлурана и наложите швы на кожу головы.

Проводите процедуру привыкания мыши в течение двух дней подряд перед началом тренировки условно-рефлекторного страха. В день тренировки поместите мышь в камеру кондиционирования на три минуты, после чего подайте разряд тока через пол силой 1,5 amp в течение двух секунд. Затем оставьте мышь в камере еще на 30 секунд перед тем, как извлечь её.

По истечении периода ожидания в 24 часа верните мышь в камеру кондиционирования на пять минут, затем оцените уровень замирания с интервалом в пять секунд через семь дней после получения травмы. Приготовьте один литр искусственной спинномозговой жидкости и 250 миллилитров раствора сахарозы для нарезки. Убедитесь, что все инструменты и растворы, используемые при подготовке срезов мозга, охлаждены на льду.

Быстро и аккуратно проведите анестезию мыши с использованием изофлурана. Извлеките мозг мыши и поместите его в раствор сахарозы. Затем подрежьте мозг.

Поместите свежесрезанную поверхность мозга на каплю суперклея на предметный столик Vibram перед блоком агара. Сделайте корональные срезы толщиной 350 micron. Таким образом можно получить четыре или пять срезов с неповрежденным контуром гиппокампа.

После этого инкубируйте срезы в течение как минимум одного часа при 37 °C. Теперь подготовьте несколько боросиликатных стеклянных электродов с сопротивлением от двух до пяти МОм. С помощью вертикального пуллера перенесите срез в камеру, затем установите электрод в держатель электродов для регистрации внеклеточных полевых потенциалов.

Расположите стимулирующий электрод над аксональным трактом в срезе, например, над путем перентоно-энторинальных волокон или коллатералями Шафера. Затем продолжайте опускать регистрирующий электрод в срез. После этого подайте одиночный электрический импульс для вызывания внеклеточного полевого постсинаптического потенциала.

Продолжайте стимуляцию, изменяя глубину погружения регистрирующего электрода между стимулами, пока не будет достигнут максимальный отклик. Это указывает на то, что электроды находятся на одном уровне. Анализ обычно включает измерения по сравнению амплитуды волоконного залпа (fiber volley) у мышей с повреждением головного мозга и в контрольной группе (ложнооперированных животных) для оценки пресинаптической активации, а также сравнение наклона F-E-P-S-P для оценки постсинаптической активации. Для проведения локальной фиксации потенциала (patch clamp) снова перенесите срез в камеру и опустите регистрирующий электрод.

Приближайте электрод к клетке, поддерживая положительное давление, чтобы предотвратить закупоривание записывающего электрода при его продвижении через ткань. Когда электрод осторожно коснется клетки, приложите отрицательное давление для создания гигаомного сопротивления (giga seal) между электродом и плазматической мембраной. Затем приложите короткие импульсы отрицательного давления, чтобы разорвать плазматическую мембрану и добиться конфигурации «целая клетка» (whole cell).

Устраните переходный процесс емкости с помощью усилителя и компенсируйте последовательное сопротивление для обеспечения точности измерений. Затем количественно определите и сравните скорость и амплитуду спонтанных синаптических токов как у мышей с травмой мозга, так и у контрольной группы с ложнооперацией. На этом этапе подготовьте стоковый раствор красителя, смешав 1 mg красителя dye three onap DHQ в 50 µL этанола.

Раздайте по 2 µL в пробирки, обернутые в фольгу, и храните при -20 °C. Ежедневно готовьте рабочий раствор красителя в разведении от 1:1 до 1:200 в A CSF. Затем инкубируйте срез на фильтровальной бумаге, увлажненной A CSF, и окрашивайте 90 µL красителя в течение 16 минут.

После этого промойте образец и поместите его в камеру для регистрации интерфейса. Разместите стимулирующие и регистрирующие электроды, как описано в разделе «Регистрация внеклеточного полевого потенциала».

Отрегулируйте интенсивность световой стимуляции до тех пор, пока отклик не окажется в центре поля зрения камеры. Изображения диапазона обычно регистрируют со скоростью от 500 до 1000 кадров в секунду. Активируйте затвор для световой стимуляции за 200 миллисекунд до электрической стимуляции, чтобы дать возможность стабилизироваться начальному быстрому фотовыгоранию.

Сделайте паузу 10 секунд между попытками. Чередуйте попытки регистрации с электрической стимуляцией и без нее, чтобы в дальнейшем можно было вычесть фоновый сигнал без электрической стимуляции. Затем зарегистрируйте интенсивность покоящегося света перед открытием затвора.

Каждый эксперимент с VSD может быть проанализирован как видеозапись показателей флуоресценции. То есть каждый эксперимент представляет собой трехмерную матрицу данных со значениями в пространственных измерениях X и Y во времени. Запишите от 10 до 12 экспериментов VSD для каждого тестового условия и рассчитайте внутрипиксельное изменение флуоресценции, нормированное по уровню до облучения, согласно сопроводительной статье.

На этом рисунке представлен пример регистрации f-EPSP в области CA1. Первое отклонение вниз — это артефакт стимуляции, за которым следует пресинаптический разряд волокон, а затем — f-EPSP. Здесь приведены кривые «вход-выход», демонстрирующие снижение чистой синаптической эффективности в CA1 после гидродинамического ударного повреждения.

Здесь представлены кривые зависимости выходного сигнала от входного, демонстрирующие увеличение чистой синаптической эффективности в зубчатой извилине после ЧМТ. Показан пример спонтанного возбуждающего постсинаптического тока от пирамидной клетки CA1. Здесь приведен пример серии потенциалов действия пирамидной клетки CA1 и быстро разряжающегося интернейрона CA1.

На данном изображении представлен тормозный интернейрон области CA1, заполненный Lucifer yellow, без дендритных шипиков, а здесь — пирамидальный нейрон области CA1, заполненный Lucifer yellow, с дендритными шипиками. На этих рисунках показан корональный срез гиппокампа мыши. Пиксели от желтого до красного цвета обозначают возбуждающую активность в области CA1 через 14 миллисекунд после стимуляции афферентных коллатералей Шафера.

Красный цвет указывает на более выраженную деполяризацию, а желтый — на менее выраженную, но все же значимую деполяризацию. Синие пиксели представляют собой участки тормозной активности в области ca 1 через 56 миллисекунд после той же стимуляции коллатералей Шафера, при этом темно-синий цвет указывает на более сильную гиперполяризацию. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое понимание того, как комбинировать несколько методов записи ex vivo для изучения клинически значимого патологического состояния, связанного с дисфункцией нейронных сетей.