Количественные исследования локомоции свободно плавающих микроорганизмов с помощью лазерной дифракции

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы измерить частоту биения свободно плавающих микроскопических организмов. Это достигается путем предварительной подготовки образца микроскопических червей. Далее подготавливается оптическая установка.

Затем регистрируется дифракционная картина, вносимая живыми организмами. Наконец, записанные данные анализируются для определения частоты плавания. В конечном счете, дифракционный анализ используется для того, чтобы показать изменения в моделях передвижения неограниченных червей.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как традиционная микроскопия, заключается в том, что можно наблюдать закономерности плавания, когда вид свободно перемещается в трехмерном пространстве. Хотя этот метод может дать представление о свободно плывущей морской элегантности, он также может быть применен к другим прозрачным, маленьким и микроскопическим организмам, подвергающимся воздействию различных условий. Чтобы настроить C elegance для анализа видео, начните с использования сплющенной платиновой проволоки для перемещения от 10 до 20 г взрослых нематод к свежим NGM.

Агар наполнен пластинами Петри, содержащими маленькие круглые пятна кишечной палочки. Дайте нематодам отложить яйца в течение трех-пяти часов, а затем удалите взрослых особей. Таким образом, создается небольшая синхронизированная по развитию культура из 50-150 нематод, чтобы вырастить нематод до раннего взрослого возраста, инкубировать чашки Петри при температуре 20 градусов Цельсия в течение четырех-пяти дней.

В день видеоанализа используйте один миллилитр деионизированной дистиллированной воды, чтобы промыть пластину молодых взрослых нематод, собрав таким образом от 50 до 150 червей из синхронизированной культуры. Используйте микроцентрифугу, чтобы прикрутить червей на дно пробирки или дайте им осесть под действием силы тяжести в течение примерно 15 минут. Он удаляет большую часть воды из трубки и заменяет ее одним миллилитром деионизированной дистиллированной воды, чтобы смыть любые прилипшие бактерии от нематод.

С помощью микропипетки перенесите от пяти до 10 нематод в воду в кварцевую вету. Соберите оптическую установку, как показано здесь, используя 543-нанометровый гелий-неоновый лазер для сверхдискретизации двух алюминиевых зеркал передней поверхности, используемых для направления лазерного луча через вете, держатель вете, проекционный экран и высокоскоростную камеру, способную снимать со скоростью около 240 кадров в секунду. Затем используйте кусочек параформы, чтобы покрыть верхнюю часть вете, и переверните его, чтобы смешать нематод с толщей воды.

Поместите вету в держатель веты так, чтобы черви изначально находились ближе к верхней части веты. С помощью зеркал направьте лазерный луч через центр веты. Поскольку нематоды плотнее воды, они будут медленно падать на дно веты во время плавания в толще воды на проекционном экране, окрашивать пятно, соответствующее проходящему лазерному лучу, в черный цвет, чтобы уменьшить рассеяние, когда проходящий луч встречается с проекционным экраном.

Устранение или уменьшение рассеяния от проходящего луча предотвратит насыщение ПЗС-матрицы камеры из-за проходящего луча. Чтобы измерить размер дифракционной картины, проведите линию длиной около пяти сантиметров на проекционном экране рядом с пятном проходящего лазерного луча, не мешая изображению дифрагированного света. Выключите свет в комнате и записывайте дифракционные изображения на экран, когда черви проходят через лазерный луч.

Чтобы подготовить видеоданные, установите следующую программу анализа видео и импортируйте видео в программу. Установите начало координат так, чтобы оно совпадало с передаваемым лазерным пятном с помощью программного обеспечения. Отслеживайте угловое смещение дифракционного изображения, образованного каждой нематодой.

Скопируйте и вставьте данные в таблицу и добавьте 180 градусов или PI для всех отрицательных углов. Построение непрерывного графика. Используя настройку для анализа видео, поместите фотодиод с небольшой областью смещения от центра в дифракционной картине непосредственно перед проекционным экраном через USB-порт.

Подключите фотодиод к цифровому осциллографу, который подключается к компьютеру. Наблюдайте за схемами взбивания на экране компьютера. Сохраняйте наборы данных в ASCI или текстовом формате для анализа данных.

Используйте видео или фотографию для импорта данных в программу анализа данных, способную подгонять осциллограммы. Использование минимизации чиквы позволяет использовать синусоидальную кривую для определения частоты обмолота. Усредните частоты плавания по различным выборкам и определите дисперсию.

Для этого исследования данные были проанализированы статистически с использованием одного фактора Inova, за которым последовал метод Бон Феррана. При множественных сравнениях значение P менее 0,05 считается статистически значимым для моделирования дифракционных картин. Начните с использования микроскопа для получения изображений для получения изображения.

Перетащите его в систему Mathematica. Используйте команду binary eyes для преобразования его в черно-белый. В качестве альтернативы можно использовать команду edge detect для создания черно-белого изображения, в котором два завершающих числа управляют шероховатостью полученных краев.

Далее с помощью команды image data преобразуйте изображение в матрицу нулей и единиц. Используйте команду forer для forer, преобразуйте матрицу, затем возведите в квадрат абсолютное значение матрицы и просмотрите результирующее изображение, которое представляет собой дифракционную картину, соответствующую исходному изображению. Кроме того, используйте функцию log для масштабирования контраста изображения.

Наконец, сравните модельные дифракционные картины с дифракционными картинами, полученными от свободно плавающих червей. В этом примере морская элегантность была изучена на кварцевой модели Q, шириной один сантиметр, толщиной пять миллиметров и высотой четыре сантиметра. Отбор проб одного червя с помощью видеоанализа.

Средняя частота плавания, полученная в результате видеоанализа у ветеринара толщиной пять миллиметров, составила около 2,5 герц. Аналогичным образом, отбор проб с одного червя с использованием метода сбора данных в реальном времени и цифрового осциллографа привел к частоте плавания около 2,7 герц. Эту процедуру можно повторить для многих червей.

Детальное изучение свободно плавающих червей выявило среднюю частоту плавания в 2,37 герц в пятимиллиметровом вете. Как и ожидалось, частота плавания выше, чем у ползающего червя. С помощью этого метода дифракции было обнаружено, что средние частоты плавания в море элегантности, ограниченные предметным стеклом микроскопа, соответствуют ранее опубликованному значению в два герца.

Следим за видео. Подготовка данных и моделирование дифракционных картин, продемонстрированных в этом видео, позволяет моделировать плавающие дифракционные картины. С помощью изображений червей, полученных с помощью обычного микроскопа, смоделированные дифракционные картины используются для моделирования цикла плавания в море элегантности.

Успешная модель состоит из физически возможного успеха схем плавания, соответствующих частоте плавания. В конце цикла плавания червь должен быть в той же форме, в которой он был в начале цикла плавания. Как только эта техника будет освоена, она может быть выполнена менее чем за минуту для каждого червя, используя быструю фотодиету, наблюдая за циклами плавания на экране компьютера.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оценивать свободно плавающих нематод.