Подготовка и инактивации болезнетворных микроорганизмов из продуктов Double Dose Buffy Coat тромбоцитов помощью перехвата системных крови

В этом видео будет представлен процесс приготовления двойной дозы тромбоцитного концентрата из пула из семи лейкоцитарных слоев (buffy coats) с последующей обработкой системой Intercept. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как производить инактивированный по патогенам тромбоцитный концентрат в двойной дозе. Сначала мы представим схематический обзор, за которым последует практическая демонстрация.

Первые семь единиц донорской цельной крови центрифугируют и разделяют для получения семи единиц лейкоцитарного слоя (buffy coat), соответствующих целевым показателям объема и гематокрита. Лейкоцитарные слои соединяют, объединяют в общий пул и центрифугируют. Затем суспензию тромбоцитов отделяют от остаточных эритроцитов для получения двойной дозы тромбоцитарного концентрата с целью инактивации патогенов и лейкоцитов.

Концентрат тромбоцитов в двойной дозе обрабатывают с помощью системы Intercept, которая осуществляет сшивку нуклеиновых кислот. В конечном итоге эта процедура позволяет получить две терапевтические дозы тромбоцитов с приемлемым качеством in vitro в течение семи дней хранения, что подтверждается оценкой pH, глюкозы, лактата, PO2, PCO2 и количества тромбоцитов. Техник из моего центра крови продемонстрирует процедуру, а требования к обработке мы опишем.

Сначала убедитесь, что двойная доза тромбоцитного концентрата соответствует спецификациям интерцепционной обработки: объем от 300 до 420 мл, доза тромбоцитов от 2,5 до 7 × 10¹¹ и содержание эритроцитов менее 4 × 10⁶ на мл. Начните данную процедуру с семи единиц цельной крови, собранных в наборы для сбора объемом 450 мл.

Поместите единицы крови в центрифужные стаканы и проведите интенсивное центрифугирование при 4 880 RCF в течение 11 минут при комнатной температуре с настройкой торможения B five согласно инструкциям производителя. После центрифугирования кровь разделится на три слоя: эритроциты, лейкоцитарный слой (buffy coat) и плазму. Перелейте плазму в верхний сателлитный пакет, а эритроциты — в нижний сателлитный пакет, оставив лейкоцитарный слой объемом примерно 48 milliliters и с гематокритом 37% в контейнере для сбора.

Поместите лейкоцитарные слои на встряхиватель для тромбоцитов при комнатной температуре на ночь; в стерильных условиях соедините семь лейкоцитарных слоев и 300 миллилитров SSP с раствором для добавок к тромбоцитам. В конфигурации для слива, при которой раствор с добавками находится сверху, пережмите трубку между раствором с добавками и первым лейкоцитарным слоем, как показано здесь. Разомкните сварные швы между единицами лейкоцитарных слоев и дайте им стечь в контейнер с последним лейкоцитарным слоем.

Затем откройте зажим и соединение между раствором-аддитивом и первым слоем лейкоцитарного слоя (buffy coat), и позвольте примерно одной трети раствора-аддитива (около 100 мл) последовательно промыть каждый из контейнеров с лейкоцитарным слоем, после чего закройте зажим; повторите промывку еще дважды, каждый раз используя примерно 100 мл раствора-аддитива. Отсоедините контейнер со смешанным лейкоцитарным слоем от пустых контейнеров. Общий объем пула лейкоцитарного слоя, включая раствор-аддитив, должен составлять примерно 600 мл.

Поместите объединенные лейкоцитарные слои на встряхиватель на один час при комнатной температуре. Затем подсоедините контейнер для хранения тромбоцитов с интегрированным лейкоредуцирующим фильтром к пакету с объединенным лейкоцитарным слоем. Поместите объединенные лейкоцитарные слои и контейнер для хранения тромбоцитов в центрифугу и центрифугируйте при 462 RCF в течение девяти минут и 20 секунд.

После центрифугирования перелейте суспензию тромбоцитов через лейкоредукционный фильтр в контейнер для хранения тромбоцитов. В результате получается двойная доза тромбоцитарного концентрата, содержащая примерно 7 × 10¹¹ тромбоцитов в 420 мл, который может быть подвергнут инактивации патогенов с помощью системы Intercept. Двойная доза тромбоцитарного концентрата обрабатывается с использованием набора для обработки Intercept, который состоит из контейнера для добавления реагента, контейнера для облучения и двух контейнеров для хранения.

Подсоедините контейнер с суспензией тромбоцитов к контейнеру с амином в наборе для перехватывающей обработки. Затем подвесьте тромбоциты. Отломите нижнюю канюлю на контейнере с амином, чтобы раствор мог поступить в контейнер для облучения.

Затем отломите верхнюю канюлю контейнера с Amin, чтобы тромбоциты могли перетечь через контейнер с Amin в контейнер для освещения. Осторожно перемешайте смесь тромбоцитов и амитозина. Слегка сжмите контейнер для освещения, чтобы удалить из него воздух.

Герметизируйте трубку между контейнером для освещения и контейнером Amato так, чтобы из контейнера для освещения выступало не более четырех сантиметров трубки. Извлеките и утилизируйте пустые контейнеры. Поместите процессинговый набор в осветитель, расположив контейнер для освещения в большом левом отделении, а органайзер — в меньшем отделении с правой стороны.

Отсканируйте идентификатор донора. Код продукта и обработка. Введите номер лота в иллюминатор.

Закройте металлическую крышку и выдвижной ящик. Нажмите кнопку «Пуск» (Start), чтобы начать облучение. Иллюминатор обеспечивает контролируемую дозу УФ-А излучения для смеси тромбоцитов с аминами в контейнере для облучения.

Амин связывается с парами оснований нуклеиновых кислот патогенов, которые могут присутствовать в единице тромбоцитов. При освещении образуются необратимые поперечные сшивки, которые скрепляют ДНК или РНК, в результате чего патогены теряют способность к репликации и вызывать заболевание у реципиента компонента крови. После освещения извлеките комплект для обработки.

Затем извлеките контейнеры из органайзера, подвесьте тромбоциты и набор для обработки. Отломите канюлю на выходе из контейнера для освещения и дайте тромбоцитам стечь в контейнер CAD. Внутри контейнера CAD находится пластина с иммобилизованными макропористыми полистирольными гранулами, которые снижают уровень остаточного амина в препарате крови.

Следя за тем, чтобы не согнуть пластину CAD, перекачайте воздух из контейнера CAD в контейнер для освещения. Герметизируйте трубку рядом с входным портом контейнера CAD.

Удалите и утилизируйте пустой контейнер для освещения. Поместите контейнер CAD с прикрепленными к нему контейнерами для хранения на встряхиватель для тромбоцитов на период от шести до 16 часов. Это приведет к снижению остаточного содержания амлина до концентрации менее или равной двум micromolar.

После обработки методом CAD извлеките единицы тромбоцитов из встряхивателя, подвесьте их, отломите канюлю на выходе из контейнера CAD и дайте тромбоцитам стечь в два контейнера для хранения. Затем удалите воздух из контейнеров для хранения. Загерметизируйте трубку выше Y-образного соединителя и снимите контейнер CAD.

В результате были получены два инактивированных по отношению к патогенам концентратов тромбоцитов для оценки функции тромбоцитов in vitro. Были определены доза тромбоцитов, pH, PO₂, содержание лактата и потребление глюкозы в интерцептах. Анализ концентратов тромбоцитов проводился на протяжении семи дней хранения.

На этом рисунке показана средняя начальная доза тромбоцитов в двойной дозе тромбоцитарного концентрата до обработки интерцептом, а также средняя доза тромбоцитов в каждом из обработанных разделенных продуктов на протяжении семи дней хранения. Как видно здесь, потеря тромбоцитов при хранении составила примерно 9%. Это снижение не отличается от ожидаемой потери тромбоцитов при хранении обычных тромбоцитов. Согласно европейским требованиям, pH тромбоцитов должен оставаться выше 6.4 до конца срока годности.

В процессе обработки pH тромбоцитарных концентратов немного снижается в зависимости от объема концентрации тромбоцитов и газопроницаемости контейнера для их хранения. На данном рисунке показано изменение pH разделенных тромбоцитарных продуктов в течение семи дней хранения; при этом pH остается стабильным и поддерживается в пределах требований к обработке. В хранящихся тромбоцитах должен продолжаться аэробный метаболизм, который служит показателем способности тромбоцитов функционировать in vivo после трансфузии пациенту.

Потребление O2 и продукция CO2 тромбоцитами свидетельствуют о продолжающемся дыхании тромбоцитов в контейнере PL 24 10 в течение семи дней хранения. Аналогично, в хранящихся тромбоцитах должен продолжаться анаэробный метаболизм. Таким образом, потребление глюкозы и продукция лактата также являются показателями способности тромбоцитов функционировать после трансфузии.

На этих двух рисунках показаны уровни лактата и глюкозы в течение семи дней хранения. Потребление глюкозы и выработка лактата тромбоцитами согласуются друг с другом. В течение семи дней хранения в пяти единицах уровни глюкозы составили менее 1,11 ммоль/л, что является нижним пределом анализа на глюкозу.

Подготовка и валидация объединения лейкоцитарных слоев (buffy coat) позволили получить тромбоцитные концентраты, соответствующие критериям для проведения интерцепционной обработки, в частности по объему, количеству тромбоцитов, соотношению плазмы и загрязнению эритроцитами. Конечные единицы соответствуют критериям валидации в течение семи дней хранения, включая дозу тромбоцитов и pH. Основным преимуществом данного метода по сравнению с традиционным способом подготовки лейкоцитарных слоев, при котором получается однодозовая тромбоцитная концентрация, является максимизация выхода компонентов из донорской крови, снижение эксплуатационных расходов за счет использования техники двойной дозы и повышение безопасности пациентов путем инактивации трансмиссивных патогенов.