Высокая эффективность, определенных сайтов Трансфекция прилипшие клетки с помощью миРНК Микроэлектродные массивы (MEA)

Общая цель следующего эксперимента заключается в достижении сайт-специфической трансфекции в адгезивных клетках. Это реализуется путем культивирования монослоя клеток на матрице микроэлектродов. На втором этапе подача электрического импульса на выбранные электроды приводит к электропорации целевых клеток, адгезированных на поверхности этих электродов.

Это приводит к образованию пор в клеточной мембране, которые обеспечивают проникновение экзогенных молекул в клетку. Затем можно провести скрининг целевых клеток для выявления результирующего фенотипа с помощью соответствующего анализа. Описанный здесь метод микромасштабной трансфекции обладает несколькими ключевыми преимуществами по сравнению с традиционными методами трансфекции, такими как объемная электропорация или химическая трансфекция.

Во-первых, это позволяет достичь исключительного пространственного контроля над самим процессом трансфекции и помогает эффективно трансфицировать отдельные клетки или группы клеток даже в тех клеточных линиях, которые трудно поддаются трансфекции. Во-вторых, этот подход легко масштабируется и позволяет реализовать высокопроизводительные молекулярные анализы. Одним из ключевых преимуществ использования микроэлектродной матрицы для сайт-специфической трансфекции является возможность одновременной функциональной оценки целевых клеток, такой как количественная электрофизиология и морфологические изменения.

Для начала процедуры простерилизуйте MEA в автоклаве, затем перенесите автоклавированный MEA в ламинарный шкаф и поместите его в стандартную стерильную полистирольную чашку Петри перед посевом клеток на MEA; простерилизуйте ламинарный шкаф, включив УФ-лампу на 20 минут. Если MEA чувствителен к УФ-излучению, накройте чашку Петри с MEA стерильной алюминиевой фольгой на время УФ-облучения в шкафу. Затем обработайте поверхность MEA фибронектином в концентрации 10 µg/mL в течение одного-двух часов для клеток helo.

Промойте MEA деионизированной водой и дайте ей высохнуть на воздухе в ламинарном шкафу. После этого соберите клетки из активной клеточной линии адгезивных клеток млекопитающих, используя трипсин-ЭДТА, и доведите их концентрацию в 1 мл питательной среды до 100–200 клеток на мкл для посева. Затем нанесите на MEA каплю среды с клетками объемом 20–30 мкл.

Убедитесь, что размер чашки достаточен для того, чтобы полностью закрыть все электроды на MEA. Затем перенесите чашку Петри с MEA в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Выдерживайте от двух до четырех часов.

После посева клеток перенесите чашку Петри с MEA из инкубатора в ламинарный шкаф. Затем осторожно добавьте от 400 до 500 µL предварительно нагретой до 37 °C среды в лунку MEA; далее проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки всё еще прикреплены и равномерно распределены по поверхности MEA. Затем перенесите MEA обратно в инкубатор. Через 8–12 часов после посева клеток выполните один или два этапа промывки с помощью PBS для удаления погибших клеток.

В типичном эксперименте клетки обычно готовы к трансфекции через 24–48 часов после посева. Для обеспечения стабильной эффективности электропорации рекомендуется дождаться, пока культура достигнет состояния, близкого к слиянию (конфлюэнтности), перед проведением электропорации. Чтобы достичь высокой эффективности трансфекции сРНК, необходимо сначала определить оптимальные параметры импульса напряжения электропорации для данной MEA.

Ниже приведено описание последовательности экспериментальных этапов с использованием пропидиййодида для определения оптимальных параметров электропорации перед проведением самой процедуры. Приготовьте от 300 до 500 µL раствора PI в концентрации 30 µg/mL в ледяном буфере для электропорации, а также 400 µL 4 µM раствора кальция-AM в PBS. Затем перенесите MEA из инкубатора в ламинарный шкаф.

Удалите культуральную среду из MEA и промойте ее с помощью PBS. Затем добавьте от 300 до 500 µL ледяного буфера для электропорации с pi. После этого поместите в MEA спейсер высотой один миллиметр.

Крайне важно следить за тем, чтобы он не касался клеток в центре MEA. После этого подключите MEA к электрическому соединителю и выберите нужные электроды для электропорации. Затем подайте электрические импульсы с требуемой амплитудой и длительностью на выбранные электроды для проведения этапа электропорации.

Опустите стальной катод, обернутый в алюминиевую фольгу, в лунку с МЭА до тех пор, пока он не коснется одномиллиметрового распора. Сразу после этого подайте электрические импульсы на выбранные электроды. Затем повторите эту процедуру с другим набором электродов в соответствии с планом эксперимента.

В наших экспериментах с клетками HELO мы наблюдали, что одиночный импульс напряжения амплитудой от 3 В до 9 В и длительностью от 1 мс до 10 мс при размере электрода 100 мкм приводил к успешной электропорации с минимальной гибелью клеток. Сразу после подачи импульсов напряжения перенесите MEA в инкубатор на пять минут.

После инкубации в течение 5–10 минут осторожно извлеките проставку из MEA. Затем удалите 75% буфера для электропорации из лунки MEA и замените его теплой питательной средой для клеток. После этого перенесите MEA обратно в инкубатор.

После инкубации в течение двух-четырех часов замените питательную среду в лунке MEA на 300–500 µL 4 µM раствора calcium AM в PBS. Перенесите MEA обратно в инкубатор еще на 30 минут для инкубации клеток с calcium AM. После этапа промывки замените calcium AM в лунке на PBS, затем получите флуоресцентные изображения клеток с помощью оптического микроскопа с фильтрами для pi.

Поглощение PI вследствие электропорации заставляет клетки флуоресцировать красным, а calcium am вызывает флуоресценцию зеленым цветом в живых клетках. Жизнеспособность клеток для каждого электрода может быть оценена по этому уравнению, а эффективность электропорации для каждого электрода — по этому уравнению. После определения оптимальных параметров электропорации их можно использовать для сайт-специфичной доставки молекулы a; процедура электропорации для молекул siRNA такая же, как и процедура электропорации для pi.

Здесь показана сайт-специфическая доставка пропидия иодида в клетки HeLa на электроде диаметром 200 мкм. Анализ жизнеспособности клеток на основе кальция был проведен через два часа после электропорации. Живые клетки отмечены здесь зеленой флуоресценцией, а красная флуоресценция здесь демонстрирует поглощение PI клетками на электроде.

Перед вами наложенное изображение. Эти клетки подверглись электропорации и живы, в то время как эти клетки мертвы. На данном рисунке показана трансфекция rumine с мечеными irna с использованием электрода диаметром 200 µm, а на этом рисунке — трансфекция клеток hela с Alexa 4 88 мечеными irna с использованием электрода диаметром 100 µm.

Белые стрелки указывают на клетки, трансфицированные irna, в то время как черные стрелки указывают на погибшие клетки. Описанный нами метод может быть применен к различным клеточным линиям, включая труднотрансфицируемые первичные клеточные линии, а также для их трансфекции более крупными молекулами, такими как плазмиды и белки.