Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

В классическом понимании взаимодействие между пре- и постсинаптическими элементами включает в себя приход потенциала действия в пресинаптическую терминаль, что за счет повышения концентрации кальция вызывает высвобождение глутамата, который активирует постсинаптические рецепторы. Однако наблюдение того, что астроциты тесно контактируют с синапсами и экспрессируют рецепторы нейромедиаторов, изменило этот взгляд, привев к концепции трехстороннего синапса. Таким образом, текущая глутаматергическая передача будет также активировать астроцит и вызывать повышение уровня внутриклеточного кальция.

Высвобождение глиотрансмиттеров, которые затем связываются с экстрасинаптическими или синаптическими рецепторами, модулирует пре- и постсинаптическую активность. Кроме того, астроциты экспрессируют основную систему захвата синаптически высвобождаемого глутамата. Помимо этого, они удаляют калий, высвобождаемый во время генерации потенциала действия и последующей постсинаптической активации, из пре- и постсинаптических окончаний через свои калиевые каналы.

Затем этот калий транспортируется внутриклеточно в области с более низким внеклеточным уровнем калия, где он высвобождается или диффундирует через щелевые контакты в соседние астроциты. Таким образом, контролируя внеклеточную концентрацию нейроактивных веществ, а также высвобождая глиотрансмиттеры, астроциты играют важную роль в определении интенсивности синаптической активности. В моей лаборатории исследуется роль нейроглиальных взаимодействий в патофизиологии головного мозга.

Таким образом, мы широко использовали и усовершенствовали этот метод, чтобы раскрыть роль астроцитов в синаптической передаче в режиме реального времени. Действительно, данный метод обладает высокой эффективностью, так как позволяет проводить онлайн-мониторинг динамических электрофизиологических ответов нейронов одновременно. Сегодня в клинике Osteocytes Evap члены лаборатории Эш и Джереми Сибель продемонстрируют вам, как выполнять данную технику, и объяснят, как она помогает нам изучать тесный диалог между нейронами и астроцитами.

Я исследовал влияние астроглиальных сетей на нейроны, синаптическую передачу и пластичность, проводя двойную регистрацию активности нейронов, а также процессов транспорта калия и глутамата в астроглии. Было установлено, что сетевое взаимодействие астроцитов способствует удалению калия и глутамата из внеклеточного пространства во время нейронной активности. Я изучил функциональные свойства и пластичность астроглии в связи с нейрофизиологией. Регистрация вызванной активности астроглии и нейронов позволила мне определить, что ответ астроцитов на активацию нейронов осуществляется преимущественно за счет калиевых токов.

Эти токи обладают собственной электрофизиологической пластичностью, которая не регулирует нейронную возбудимость и пластичность. Иными словами, астроциты представляют собой крайне возбужденные нейроны. Здесь мы представим важный метод одновременного исследования активности нейронов и астроглии в острых срезах гиппокампа путем двойной регистрации мембранных токов астроцитов и нейронных полевых потенциалов, вызванных стимуляцией пресинаптических волокон.

Кроме того, мы проведем парные регистрации одиночных нейронов и прилегающих астроцитов, чтобы изучить гликогенные ответы ASTO во время нейронной активности. Мы выбрали гиппокамп, так как этот отдел характеризуется выраженной анатомической и функциональной компартментализацией и хорошо изучен с точки зрения нейронных цепей, а также синаптической активности и пластичности. Начните эксперименты с подготовки срезов мозга гиппокампа; для этого первым делом подготовьте охлажденный оксигенированный раствор.

Искусственная спинномозговая жидкость: глубоко анестезируйте мышей, быстро проведите декапитацию и поместите голову в ИСМЖ. Вскройте череп, сделав три разреза, чтобы разделить два полушария. В завершение перенесите их в оксигенированную ИСМЖ.

Оставьте для равномерного перемешивания примерно на пять минут. Теперь начните с одного полушария. Препарирование гиппокампа начинается с удаления среднего мозга.

На данном рисунке подробно показана процедура диссекции гиппокампа. Сначала поместите отделенное полушарие на соответствующую область коры головного мозга, чтобы получить доступ к среднему мозгу. С помощью двух ложечек удалите средний мозг.

Теперь гиппокамп будет виден, как показано пунктирными линиями. Аккуратно извлеките гиппокамп с помощью ложки, начиная с fia, которая видна как широкая структура. Вставьте ложку под гиппокамп и с помощью второй ложки отсеките кору, прилегающую к гиппокампу.

Перенесите гиппокамп в небольшой культуральный чан с оксигенированным A CSF и повторите процедуру для второго полушария. Поместите оба гиппокампа на небольшой блок AGA стороной альвеол вверх. Теперь аспирируйте DS A CSF. Приклейте гиппокамп к устройству камеры для срезания.

Перенесите гиппокамп в камеру для нарезки и сделайте срезы толщиной 300 или 400 мкм. Соберите срезы в камере для хранения с оксигенацией и оставьте их минимум на один час перед записью при комнатной температуре для проведения целостных записей одиночных астроцитов. Перенесите срез гиппокампа на покровное стекло, покрытое полилизином.

Удалите излишки A CSF, чтобы обеспечить прикрепление среза гиппокампа к покрывной стеклу с поли-L-лизином, после чего снова добавьте A CSF на срез. Перенесите срез в записывающую камеру, в которой постоянно проводится перфузия оксигенированным A CSF со скоростью 1–2 мл/мин. Для идентификации астроцитов при проведении записей методом патч-клампа можно использовать мышей, экспрессирующих EGFP под специфическим для астроглии промотором GFAP.

Заполните стеклянную пипетку с сопротивлением от четырех до шести мегаом фильтрованным холодным внутриклеточным раствором; используя внутриклеточный раствор, содержащий родамин, вы сможете визуализировать патч-клампированный астроцит красным цветом на фоне зеленых. Видны соседние астроциты, экспрессирующие EGFP. Под управлением промотора GFAP астроциты могут быть идентифицированы по небольшому размеру сомы (около 10 мкм) и разветвлению основного отростка, который обычно включает три или четыре ветви.

Шприц, соединенный трубкой с пипеткой, позволяет создавать избыточное давление при погружении в ткань в окне команд; подайте тестовый импульс напряжением 10 millivolt и обнулите ток удержания. Затем с помощью микроманипулятора переместите пипетку в ткань для приближения к клетке. При достижении поверхности клетки продолжайте движение до появления вмятины, видимой как отклонение света, что указывает на небольшую деформацию поверхности клетки.

Благодаря приложению положительного давления мембрана астроцита плотно прилегает к отверстию стеклянного пипеточного наконечника, что проявляется в виде возрастания сопротивления при формировании гигаомного контакта (giga seal). Выполните компенсацию емкости, перейдя в общую конфигурацию, путем осторожного приложения отрицательного давления, наблюдая за соответствующими параметрами в окне команд. Прорыв мембраны клетки будет заметен по прохождению тока через нее.

Применение серии гиперполяризующих и деполяризующих ступеней напряжения позволяет охарактеризовать свойства клеточной мембраны; астроциты обычно демонстрируют только пассивные токовые ответы. Инъекция тока в режиме фиксации тока (Current clamp) не приводит к возникновению потенциала действия. Отсутствие разрядов служит дополнительным подтверждением того, что вы действительно установили патч-зажим на астроците. Добавление в патч-пипетку трекера, такого как Sulforhodamine B, позволяет визуализировать исследуемый астроцит.

Кроме того, пассивная диффузия трассера в течение 20 минут в режиме фиксации тока позволяет визуализировать соседние астроциты, соединенные через щелевые контакты, для проведения двойных записей возбуждающей нейрональной передачи и последующих вызванных астроцитарных токов. Сначала мы блокируем тормозную передачу с помощью precor toin, чтобы предотвратить гипервозбудимость, возникающую в отсутствие ГАМК-ергической передачи. Мы пересекаем связи между CS three и C one, опосредованные коллатералями shaer, с помощью маленького ирисового ножа.

Затем мы устанавливаем стимулирующий электрод для CSF, регистрирующий полевой электрод и электрод для патч-кламп записи астроцита. В срезе гиппокампа мы выбираем астроцит и располагаем полевой электрод на расстоянии 200 мкм от него, чтобы убедиться, что астроцит действительно интегрирует активность, регистрируемую полевым электродом; при этом стимуляция коллатералей Шафера должна вызывать возбуждающий полевой потенциал. Этот полевой потенциал состоит из волоконного компонента, отражающего количество стимулированных аксонов, и последующей постсинаптической деполяризации, что позволяет проводить одновременную запись полевых потенциалов нейронов и токовых ответов астроглии в конфигурации whole-cell.

Сначала расположите электрод для внеклеточной записи примерно в 50 µm от выбранного астроцита. Затем переместите патч-электрод к соме астроцита и выполните патч-кламп; убедитесь, что выбранная клетка действительно является астроцитом, исходя из её пассивных мембранных свойств. Теперь, стимулируя Shaer Cs, можно одновременно регистрировать нейронную активность и последующий ток в астроците, который представляет собой длительный ответ до 50 pA благодаря сетевой связности и тому факту, что один астроцит контактирует с синапсами до 100 нейронов.

Эти клетки интегрируют активность большого количества одновременно активированных синапсов для проведения двойной внеклеточной регистрации отдельных нейронов и прилегающих к ним астроцитов; для этого два патч-электрода опускают в область stratum radiatum среза гиппокампа. В области CA1 идентифицируйте интересующий нейрон, а на той же глубине на расстоянии примерно 20–60 µm — астроцит, затем расположите обе пипетки примерно на 10 µm выше каждой клетки, подавая положительное давление. Пипетку для регистрации астроцита следует расположить как можно ближе к целевому астроциту, чтобы избежать дальнейших механических смещений.

Сначала установите гигаомное сопротивление (gga seal) на нейроне. Теперь переходите к патчингу астроцита, который обычно герметизируется медленнее, чем нейроны. Резюмируя основные этапы проведения двойных регистраций в режиме whole-cell, сначала опустите две регистрирующие пипетки в срез.

Приблизитесь к соме астроцита, затем выполните gga-герметизацию нейрона и завершите процедуру gga-герметизацией астроцита; нейроны обычно обладают гораздо более высоким сопротивлением мембраны, чем астроциты, что для пирамидальных нейронов составляет около 200–500 mega при фиксации обеих клеток. Теперь в режиме фиксации потенциала (voltage clamp) при гиперполяризации мембраны активируются переходные натриевые токи в нейроне и пассивные калиевые ответы в астроците. Здесь мы демонстрируем, что индукция быстрых возбуждающих постсинаптических полевых потенциалов путем стимуляции коллатералей shaa вызывает последующий длительный токовый ответ.

Ингибирование ионотропных глутаматных рецепторов в прилежащем астроците с помощью ремиковой кислоты показывает, что большая часть астроглиального тока обусловлена возбуждающей постсинаптической активацией. Оставшийся ответ B AIC состоит из быстрого транзиторного переноса глутамата, чувствительного к TBOA, и небольшого длительного тока, вероятнее всего, вызванного пресинаптическим высвобождением калия во время потенциала действия. Ток в астроците очень надежно отслеживает постсинаптическую активность, поскольку оба показателя линейно возрастали при увеличении пресинаптической активности.

Кроме того, астроцитарные токи, подобно нейронным ответам, проявляют облегчение при парной стимуляции. Умеренная одиночная стимуляция коллатералей Шафера индуцирует относительно большой синаптически вызванный астроцитарный ток по сравнению с небольшой вызванной деполяризацией, регистрируемой в той же клетке в режиме фиксации тока. Это обусловлено низким мембранным сопротивлением астроцитов.

Регистрация динамики мембранного потенциала глиальных клеток TTO, вызванной синаптически, является прямым методом измерения локального уровня внеклеточного калия. При проведении парных записей нейрона и прилегающего астроцита мы не наблюдали астроцитарного токового ответа во время генерации нейроном потенциалов действия, что указывает на отсутствие электрической связи между ними. Возбуждающий постсинаптический потенциал, вызванный в области CS 3, также вызывал астроцитарные токовые ответы. Кроме того, стимуляция в области CS 1 сильно потенцировала нейронный ответ в области CS 3, но лишь умеренно увеличивала астроцитарный ток.

После просмотра этого видео вы получите более глубокое понимание того, как правильно организовать и провести успешные двойные электрофизиологические регистрации нейронов и астроцитов. С помощью этого метода вы сможете изучать динамическую передачу сигналов между нейронами и астроцитами в режиме реального времени для анализа интересующего вас электрофизиологического ответа. В частности, вы сможете исследовать, способствуют ли новые взаимодействия между глией и нейронами, включающие функции и модуляцию ионных каналов, формированию физиологических или патологических состояний.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в проведении вашего эксперимента.