Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Подготовка острых кусочков мозга от изолированного гиппокампа, а также одновременное электрофизиологических записей астроцитов и нейронов в

Связь между пресинаптическими и постсинаптическими элементами включает в себя потенциал действия, поступающий к пресинаптическому окончанию, который запускается за счет увеличения кальция, высвобождение глутамата, активирующего постсинаптические рецепторы. Тем не менее, наблюдение о том, что астроциты тесно контактируют, синопсис и экспрессируют рецепторы нейротрансмиттеров, изменило его взгляд на концепцию трехчленного синапа. Таким образом, продолжающаяся глутаматергическая передача также активирует астроциты и запускает внутриклеточное повышение уровня кальция.

Высвобождение глиотрансмиттеров, которые затем могут связываться с экстрасинаптическими или синаптическими рецепторами, модулирует пре- и постсинаптическую активность. Кроме того, астроциты экспрессируют основную систему поглощения синаптически высвобождаемого глутамата. Кроме того, они очищают калий, который высвобождается во время действия, потенциального возбуждения и последующей постсинаптической активации из пре- и постсинаптического конца через свои калиевые каналы.

Затем этот калий внутриклеточно транспортируется в участки с более низкими внеклеточными уровнями калия, где он высвобождается или диффундирует через щелевые соединения в соседние астроциты. Таким образом, контролируя внеклеточную концентрацию нейроактивных веществ, а также высвобождая прозрачные трансмиттеры, астроциты играют важную роль в определении силы синаптической активности. Моя лаборатория исследует роль нейроглиальных взаимодействий в церебральной физиопатологии.

Таким образом, мы широко использовали и усовершенствовали эту технику, чтобы распутать стенку астроцитов в процессе синаптической передачи. Действительно, эта техника является мощной, поскольку она позволяет отслеживать в режиме онлайн и одновременно динамические электрофизиологические реакции нейронов. И как сегодня в клинике Osteocytes Evap, Эш и Джереми Зибел сотрудники лаборатории продемонстрируют вам, как выполнять эту технику и объяснят, как она помогает нам, в интимном диалоге между нейронами и астроцитами.

Я исследовал влияние астроглайдных сетей на нейроны, синаптическую передачу и пластичность, выполняя двойную запись активности нейронов и астроглиевых калиевых и перегруженных транспортных процессов, и обнаружил, что аслинная сеть способствует внеклеточному удалению калия и глутамата во время нейронной активности. Мною исследована природа, свойства и пластичность возникновения астроглии применительно к нейрофизиологии. Во время регистрации астроглии и активности нейронов позвольте мне идентифицировать реакцию астроцитов на активацию нейронов, в основном калийными токами.

Этот ток имеет свою собственную электрофизиологическую пластичность, которая не регулирует нейронную приемлемость и пластичность. Другими словами, обратный отсчет астроцитов, очень возбужденный. Невроз. Здесь мы представим важный метод одновременного исследования активности мочеиспускательного аппарата и астроглии в острых срезах гиппокампа путем проведения двойных записей токов астроцитарной мембраны и потенциалов питания мочевого аппарата, вызванных стимуляцией пресинаптических волокон.

Кроме того, мы выполним парные записи отдельных нейронов и прилегающих астроцитов для исследования ответов ASTO gly во время нейронной активности. Мы выбрали гиппокамп, потому что эта область демонстрирует сильную анатомическую и функциональную компартментализацию и хорошо характеризуется с точки зрения нейронных схем, а также синаптической активности и пластичности. Начните эксперименты с приготовления срезов мозга гиппокампа для этого первого льда, называемого кислородом.

Искусственная спинномозговая жидкость, глубоко обезболит ваших мышей и быстро отрежет голову и переведет в спинномозговую жидкость. Вскрыть череп с тремя надрезами, теперь разделенными двумя полушариями. Наконец, переведите их в насыщенную кислородом спинномозговую жидкость.

Дайте ему равномерно заплетать около пяти минут. Теперь начнем с Одного полушария. Рассечение гиппокампа начинается с удаления среднего мозга.

Подробное вскрытие гиппокампа теперь проиллюстрировано на этом рисунке. Сначала расположите отделенное полушарие на его корковом участке, чтобы получить доступ к среднему мозгу. С помощью двух ложек удалите средний мозг.

Теперь гиппокамп будет виден, как показано пунктирными линиями. Рассекайте гиппокамп ложкой, начиная с фиа, которая видна как широкая структура. Вставьте ложку ниже гиппокампа и с помощью второй ложки отрежьте кору, прилегающую к гиппокампу.

Перенесите гиппокамп в небольшую чашку для культуры с кислородом A CSF и продолжайте со вторым полушарием Расположите обоих бегемотов на небольшом блоке AGA альвео стороной вверх. Теперь отсосите DS A CSF. Приклейте бегемота к устройству камеры для нарезки.

Перенесите гиппокамп в камеру для нарезки и нарежьте ломтики размером 300 или 400 микрометров. Соберите срезы в кислородной камере для хранения и дайте им отдохнуть не менее одного часа перед записью при комнатной температуре, чтобы выполнить оптовую регистрацию отдельных астроцитов. Наденьте срез гиппокампа на покровную накладку с полилизиновым покрытием.

Высушите излишки A CSF, чтобы можно было прикрепить срез гиппокампа к защитному листу с полиэтиленовым покрытием, а затем снова добавьте A CSF поверх среза. Перенесите срез в записывающую камеру, которая постоянно перфузируется кислородосодержащим А ликвором со скоростью перфузии один-два миллилитра в минуту. Для идентификации астроцитов мыши, экспрессирующие EGFP под астроглией, можно использовать специфический промотор GFAP.

Заполните стеклянную трубку с сопротивлением от четырех до шести мега Ом отфильтрованным холодным внутриклеточным раствором, используя внутриклеточный раствор, содержащий родда дрон, вы можете визуализировать красным цветом пятнистый астроцит зеленым цветом. Вы видите соседние астроциты, экспрессирующие EGFP. С помощью промотора GFAP астроциты могут быть идентифицированы по их небольшому размеру сомы около 10 микрометров и их основному разветвлению отростка, включающему обычно от трех до четырех ветвей.

Шприц, подключенный к пипетке через трубку, позволяет подавать положительное давление во время спуска в ткань в командном окне, запускать тестовый импульс в 10 милливольт и восстанавливать удерживающий ток. Затем переместите пипетку с помощью Микроманипулятора внутрь ткани, чтобы приблизиться к клетке. Когда мы достигаем поверхности клетки, мы продвигаемся дальше, пока не видим ямочку, видимую как легкое отклонение, указывающее на то, что мы немного деформируем поверхность клетки.

Благодаря приложению положительного давления, мембрана астроцитарной клетки теперь будет плотно прилегать к отверстию на стеклянном наконечнике пайпера, что можно наблюдать по возрастающему сопротивлению при достижении гига-уплотнения. Выполнение компенсации емкости переходит в оптовую конфигурацию путем мягкого приложения отрицательного давления при наблюдении за испытуемыми деталями в окне команд. Прорыв в клетку будет виден по току, протекающему через мембрану.

Применение ряда гиперполяризационных и деполяризационных напряжений позволяет охарактеризовать свойства клеточной мембраны. Астроциты обычно проявляют только пассивные отклики на ток. Инжекция тока в режиме токового зажима не приводит к возникновению потенциала действия. Давая еще одно подтверждение того, что вы действительно заплатили астроцитарное добавление индикатора, такого как сера или домин B к вашему пластырю, пипет позволяет визуализировать запатченный астроцит.

Кроме того, пассивная диффузия индикатора в течение 20 минут в режиме тока зажима позволяет визуализировать щель соединительных соединенных соседних астроцитов, выполнять двойные записи нейрональной возбуждающей передачи, а затем вызываемые астроцитарные токи. Сначала мы блокируем ингибиторную передачу с помощью прекортоина, чтобы предотвратить гипервозбудимость, которая возникает при отсутствии ГАМКергической передачи. Мы вырезали опосредованные шей коллатерали между CS three и C one с помощью маленького ножа для ириса.

Затем мы размещаем электрод для стимуляции поля спинномозговой жидкости, электрод для регистрации поля и электрод для зажима астроцитарного пластыря. В срезе гиппокампа мы выбираем астроцит и располагаем полевой электрод на расстоянии 5 200 микрометров от него, чтобы гарантировать, что астроцит действительно интегрирует активность, зарегистрированную с помощью полевого электрода. Этот потенциал поля состоит из стенки волокна, отражающей количество стимулированных аксонов и последующей постсинаптической деполяризации для выполнения двойной записи потенциалов питания нейронов и реакций тока всей клетки астроглии.

Во-первых, расположите электрод для регистрации поля на расстоянии около 50 микрометров от выбранного астроцита. Затем переместите патч-электрод к астроцитарной соме и пластырному зажиму, выбранная клетка будет проверена по своим пассивным мембранным свойствам, что она действительно является астроцитом. Теперь, стимулируя Shaer Cs, мы можем одновременно регистрировать нейронную активность и последующий астроцитарный ток, который заключается в длительном до 50 мкм ответе из-за их сетевой связности и того факта, что один астроцит контактирует с синапсами до 100 нейронов.

Эти клетки интегрируют активность большого количества одновременно активированных синапсов для выполнения двойных целых клеточных записей отдельных нейронов и прилегающих астроцитов опускаются с помощью двух патч-электродов в область слоя среза гиппокампа. Определите в одной области C интересующий вас нейрон на той же глубине от 20 до 60 микрометров, а затем расположите обе пипетки на расстоянии около 10 микрометров над каждой клеткой, применяя положительное давление. Пипетка для записи астроцитов должна быть расположена как можно ближе к целевому астроциту, чтобы избежать дальнейших механических движений.

Во-первых, добейтесь уплотнения gga на нейроне. Теперь приступайте к наложению пластыря на астроцит, который обычно запечатывается медленнее, чем нейроны. Чтобы подвести итог важным шагам для выполнения двойной оптовой записи, сначала опустите две записывающие трубки в слайс.

Подойдите к соме астроцита, затем выполните герметизацию gga на нейроне и завершите выполнением герметизации gga на астроцитах, нейроны обычно имеют гораздо более высокую мембранную резистентность, чем астроциты, что составляет от 200 до 500 мега с обеими клетками. Теперь в режиме напряжения зажима T и гиперполяризации мембрана активирует переходные токи натрия в нейроне и пассивные реакции калия в астроците. Здесь мы показываем, что индукция быстрых возбуждающих потенциалов постсинаптического поля путем стимуляции коллатералей shaa вызывает последующую длительную реакцию тока.

В соседних астроцитах ингибирование ионотропных глутаматных рецепторов с помощью реминовой кислоты показывает, что большая часть астоглиевого тока обусловлена возбуждающей постсинаптической активацией. Оставшаяся реакция B AIC состоит из быстрого переходного переноса глутамата, чувствительного к TBOA, и небольшого длительного тока, скорее всего, из-за высвобождения пресинаптического калия во время действия. Потенциальное возбуждение асцитического тока очень надежно отслеживает постсинаптическую активность, поскольку оба увеличиваются линейно при одновременном увеличении пресинаптической активности.

Кроме того, астроцитарные токи проявляют схожие нейронные реакции, облегчение парного пульса. Умеренная однократная стимуляция шейных коллатералей индуцирует относительно большой синаптически вызванный асо гли ток по сравнению с небольшой вызванной деполяризацией, зарегистрированной в той же клетке в режиме токового зажима. Это связано с низкой мембранной резистентностью астроцитов.

Регистрация динамики потенциала синаптически вызванной мембраны TTO gly является прямым измерением локального внеклеточного уровня калия путем выполнения парных записей нейрона и соседнего астроцита, мы не наблюдали реакции астроцитарного тока, в то время как нейрон активировал потенциалы действия, что указывает на то, что они не были электрически связаны, возбуждающий постсинаптический потенциал, вызванный в трех областях CS, также вызывает реакцию астроцитарного тока. Кроме того, во-первых, ее стимуляция сильно потенцировала нейронный ответ в третьей области CS. Он лишь умеренно увеличивал астроцитарный ток.

После просмотра этого видео мы должны лучше понять, как настроить и выполнить успешную двойную электрофизиологическую запись нейронов и цитов. Используя эту методику, вы можете изучить динамическую передачу сигналов между нейронами и астроцитами для интересующей вас электрофизиологической реакции. В частности, можно исследовать, способствуют ли новые взаимодействия GL, включающие функции и модуляции железных каналов, определению физиологических или патологических ситуаций.

Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.