Оптический захват наночастиц

Общая цель данной процедуры — создать установку для апертурного оптического захвата, предназначенную для захвата частиц размером около 20 нанометров. Для этого к существующей установке оптического лазерного захвата добавляется детектор для обеспечения возможности измерения. Затем измеряемый раствор наночастиц дозируется в микрофлюидную камеру с двойной наноотверстия-ловушкой, и камера устанавливается в систему оптического захвата.

Когда частица попадает в освещенное отверстие, пропускание света резко возрастает из-за диэлектрической нагрузки. Если частица пытается покинуть отверстие, снижение пропускания вызывает изменение импульса, направленное от отверстия, что, согласно третьему закону Ньютона, создает силу, притягивающую частицу обратно в отверстие и удерживающую ее там. Частица вызывает красное смещение кривой пропускания, за которым можно наблюдать.

Таким образом, ловушка может служить сенсором. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие события захвата наночастиц, включая разворачивание захваченных белков, что фиксируется по изменению интенсивности лазерного излучения, проходящего через двойное наноотверстие. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как оптический захват с использованием градиентной силы, является возможность захвата более мелких наночастиц при более низкой интенсивности лазерного излучения.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы биохимии, такие как механизмы фолдинга и взаимодействия отдельных белков, а также способы инфицирования живых клеток вирусными частицами. Как правило, исследователи сталкиваются с трудностями при использовании данного метода, так как интеграция двойного наноотверстия в существующую систему лазерного захвата представляет собой сложную задачу. Установка для оптического захвата основана на комплекте для оптического пинцета от Thor Labs, оснащенном модулем измерения силы.

Лавинный фотодиод используется для замены квадрантного детектора в модуле измерения силы. При настройке системы оптического захвата необходимо использовать средства защиты глаз всякий раз, когда лазер включен. Убедитесь, что луч ограничен безопасной зоной, работая в закрытом помещении и максимально локализуя луч внутри установки захвата; следует избегать ношения отражающих украшений.

Наденьте латексные перчатки. Для обеспечения чистоты оптики установите комплект оптического пинцета и модуль измерения силы. Согласно инструкциям производителя, собранный комплект оптического пинцета представляет собой инвертированный световой микроскоп и состоит из следующих компонентов: ловушечного лазера, иммерсионного объектива 100x (масляного), трехкоординатного предметного столика и CCD-камеры.

Обратите внимание, что при работе с лазерными диодами рекомендуется использовать защиту от электростатического разряда. Модуль измерения силы позволяет калибровать оптические пинцеты с помощью позиционного детектирования задней фокальной плоскости конденсатора. Вместо модулей измерения силы используется лавинный фотодиод (APD) на силиконовой основе или фотодиод (PD).

В детектор квадрантной позиции также вставляют резистор-конденсатор или RC-фильтр, состоящий из резистора 200 kΩ и конденсатора 100 pF. Это используется для снижения высокочастотного шума и облегчения визуализации событий захвата на осциллографе. Используйте коаксиальный кабель для подключения RC-фильтра после APD. Затем с помощью коаксиальных кабелей и Т-образного адаптера подключите осциллограф и модуль сбора данных к RC-фильтру.

Система готова к загрузке образца. Двойная наноотверстие-апертура состоит из двух наноотверстий, вытравленных в золотой пленке с помощью сфокусированного ионного пучка. Толщина пленки составляет 100 nanometers, она закреплена на стеклянной подложке.

Наноотверстия перекрываются, образуя два острых каспом. Наночастицы будут захвачены в зазоре между этими каспами лазерным излучением, падающим на двойное наноотверстие.

В металлической пленке также следует выфрезеровать крупные метки совмещения, чтобы облегчить определение местоположения двойного наноотверстия подt оптическим микроскопом. Эти элементы должны располагаться на расстоянии около 100 microns от двойного наноотверстия. Налейте 10 grams полидиметилсилоксана или основы PDMS и один грамм отвердителя в одноразовый стакан. Перемешивайте в течение нескольких минут.

Затем удалите воздух из смеси в вакуумной камере до полного исчезновения пузырьков. Далее налейте 1,5 грамм PDMS в чашку Петри диаметром девять сантиметров. Нанесите PDMS на дно чашки Петри методом центрифугирования при 950 RPM в течение 65 секунд после начала вращения.

Толщина не является критическим параметром, если она не превышает 80 микрон. Осторожно поместите три-пять покровных стекол № 1,5 на PDMS так, чтобы они не перекрывали друг друга, и подвергните вакуумированию в течение 30 минут.

Если во время вакуумирования покровные стекла сместились и наслоились друг на друга, осторожно раздвиньте их. Убедитесь, что слой PDMS под покровными стеклами остается тонким и равномерным. Затем снова подвергните чашку Петри вакуумированию в течение 30 минут.

Извлеките чашку Петри из вакуумной камеры и нагрейте ее на нагревательном столе в течение 20 минут при 85 °C для отверждения PDMS. После затвердевания PDMS с помощью лезвия бритвы сделайте надрезы вдоль краев одного из покровных стекол. Затем, используя пинцет с тонким кончиком или лезвие, аккуратно подденьте стекло; тонкий слой PDMS прилипнет к покровному стеклу.

Поместите покровное стекло с PDMS в новую чашку Петри. Затем с помощью лезвия бритвы вырежьте в PDMS окно размером 3 мм на 3 мм. Это окно станет камерой, в которой будет находиться раствор наночастиц.

С помощью лазерного резака изготовьте держатель для предметных стекол микроскопа из акрила с отверстием диаметром 3/4 дюйма в центре. Наклейте двусторонний скотч по окружности отверстия. С помощью лезвия бритвы удалите излишки скотча.

Поместите изготовленный предметное стекло на одно из подготовленных покровных стекол с покрытием из PDMS так, чтобы слой PDMS оказался зажат между стеклом и акрилом. С помощью микропипетки добавьте несколько капель 0,05% (масс./об.) раствора полистирольных наносфер в окно из PDMS.

Нанесите одну каплю на золотую пленку в месте расположения наноотверстий. Поместите образец золота на покровные стекла так, чтобы наноотверстия оказались внутри окна из PDMS. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха в камере.

Затем прижмите золотой образец к покровному стеклу. Промокните излишки раствора, так как будет использоваться иммерсионный объектив. Нанесите каплю иммерсионного масла на другую сторону покровного стекла, поверх окна из PDMS.

Обратите внимание на расположение наноотверстий. Установите микроскоп. Вставьте предметное стекло в держатель стеклом вниз, затем опускайте держатель до тех пор, пока иммерсионное масло не вступит в контакт с микроскопом.

Цель: примерно совместить предметный столик так, чтобы реперные метки, выгравированные в золотой пленке, оказались под объективом. С помощью программного обеспечения для захвата изображений, такого как ThorSight, которое входит в комплект установки для захвата, найдите реперные метки на золотой пленке и следуйте по направляющим линиям к наноотверстиям.

Расположите предметное стекло таким образом, чтобы индикаторные метки и другие открытые области находились вне центра экрана. Избыточное пропускание света может повредить A PD; включите лазер. Поскольку дихроичное зеркало не является идеальным, вблизи центра экрана должно появиться пятно от лазерного луча.

Используйте программное обеспечение для управления пьезостоликом. Далее более точно настройте юстировку по всем трем осям. При правильной юстировке будет наблюдаться максимальное напряжение на фотодиоде (PD), что указывает на наивысший уровень пропускания через наноапертуру.

После настройки системы и загрузки образца можно приступить к сбору данных оптического захвата. С помощью индикационных меток расположите пятно рядом с известным местоположением наноотверстия. Двойные наноотверстия будут слишком малы для четкого разрешения и будут выглядеть на экране как маленькие точки.

Пропускание света через образец определяется по уровню сигнала на осциллографе. Продолжайте юстировку образца до достижения максимального пропускания света. Обращайте внимание на индикаторные метки, а также на видимые и невидимые царапины, так как в этих областях пропускание света будет высоким; при этом наноотверстия будут проявляться в виде резких скачков пропускания света, в отличие от царапин.

Для обеспечения более плавных изменений используйте волновую пластинку. Отрегулируйте поляризацию света для достижения максимального пропускания, так как структура с двойными наноотверстиями поляризована. Для сбора данных регистрируйте напряжение на APD с помощью модуля сбора данных в течение требуемого времени.

Время сбора данных обычно составляет сотни секунд. В данном случае для сбора данных используется специализированное программное обеспечение, а выборка напряжения производится с частотой 2000 раз в секунду. С помощью MATLAB отфильтруйте полученные данные, используя фильтр Кайзера-Голе, и постройте график зависимости от времени, чтобы продемонстрировать захват полистирольных наночастиц размером 20 нанометров; пропускание через двойное наноотверстие измерялось как функция времени.

Затем был построен график оптического пропускания PD. Со временем событие захвата характеризуется внезапностью с резким переходом, демонстрирующим четкое переключение между двумя уровнями мощности пропускания, как показано на этом примере; при этом в состоянии захвата часто наблюдается увеличение шума сигнала. Этот рост шума обусловлен броуновским движением захваченной частицы.

Обратите внимание, что в отсутствие захваченной частицы данный источник шума отсутствует. В результатах могут появиться артефакты, которые не указывают на события захвата. Результаты, демонстрирующие дрейф, который проявляется в виде медленных изменений пропускания в течение нескольких минут, как показано здесь, следует исключить. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как КР-спектроскопия и флуоресцентная спектроскопия, чтобы получить ответы на дополнительные вопросы о природе захваченной наночастицы после ее развития.

Эта методика открыла исследователям путь к изучению биологически значимых наночастиц на уровне отдельных молекул. Например, для регистрации связывания белков и изучения вирусной инфекции на уровне одиночных молекул. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как интегрировать двойную оптическую ловушку в систему лазера инвертированного микроскопа для захвата одиночных наночастиц.