Выделение нормальных и раковых связанных Фибробласты из свежих тканей флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS)

Рак Associated фибробластов (CAFS) содействие раковых клеток, рост и прогрессию через понять, что способствует пролиферации, ангиогенеза и воспаления. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать чистые популяции нормальных фибробластов и CAFS из свежих мышиных и человеческих тканей сортировки клеток, используя PDGFRα как поверхность маркером.

Целью этой процедуры является выделение нормальных и ассоциированных с раком фибробластов из свежих тканей. Это достигается путем предварительного рассечения молочных желез. Вторым этапом является получение молочных желез, суспензий одиночных клеток, последующих клеток, поддерживаемых фибробластами специфическими антителами, а также антителами, специфичными для других клеточных популяций.

Последним шагом является поиск источников флуоресцентных активированных клеток или фактов. В конечном счете, для оценки чистоты отсортированных клеточных популяций используется профилирование экспрессии Q-R-T-P-C-R специфических маркеров, экспрессируемых в отсортированных клеточных популяциях. Основное преимущество этого метода перед существующими методами выделения фибробластов заключается в том, что он позволяет изолировать большинство тканевых фибробластов с минимальным загрязнением иммунными клетками или эпителиальными клетками, избегая при этом этапа культивирования тканей, который может изменить профиль экспрессии генов фибробластов.

Применение этого метода распространяется на все виды терапии рака молочной железы, поскольку понимание и идентификация молекулярных мишеней может обеспечить новый подход комбинатора для борьбы с прогрессированием рака молочной железы, продлить выживаемость пациентов и, в конечном итоге, помочь улучшить и адаптировать индивидуальные терапевтические варианты. В дополнение к вашему глазу, только доктор Лена, менеджер лаборатории будет демонстрировать процедуру, чтобы начать эту процедуру. Положите усыпленную самку мыши на спину на поверхность из пенополистирола и с помощью игл 25 калибра прочно приколите все четыре конечности.

Обильно распылите на мышь 70% этанола с помощью щипцов. Подтяните кожу живота по средней линии и сделайте небольшой разрез острыми ножницами, начиная с разреза. Разрежьте кожу до шеи животного, избегая при этом прокола брюшной грудной полости.

Разрежьте кожу на задних ногах от разреза по средней линии к ноге, в результате чего получится Y-образная форма. Затем оттяните кожу от тела мыши и прижмите к ней, обнажив молочные железы, прикрепленные к нижней части кожи. Одним из самых проблемных моментов в этой процедуре является избегание забора мышечной ткани.

Для того, чтобы избежать этой проблемы, я буду брать только четвертую и пятую молочную железу а не вторую, которая находится в непосредственной близости от мышечной ткани. Используйте ватные палочки, чтобы аккуратно отделить железу памяти от кожи, разрезая соединительную ткань маленькими острыми ножницами, чтобы отделить железу памяти по направлению к позвоночнику мыши, удалите все обнаруженные некротические участки. Поместите рассеченные железы памяти в PBS на лед.

Самый простой способ получить кожную ткань без необходимости заниматься эпиляцией – использовать уши мыши. Острыми ножницами отрежьте оба уха у усыпленной мыши. Немедленно поместите уши в банку для пищеварения, содержащую небольшой объем PBS на льду.

Для приготовления суспензии одиночных клеток молочной железы с помощью изогнутых ножниц тщательно измельчить молочные железы в банке для пищеварения, содержащей небольшой объем PBS на льду, добавить в рубленую ткань 20 миллилитров раствора коллагеназы. Это количество раствора коллагеназы эффективно диссоциирует примерно пять граммов памяти или опухолевой ткани и ушей у 15 мышей. Немедленно поместите на тарелку для перемешивания на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия и выдерживайте в течение 15 минут, помешивая со средней скоростью, чтобы остановить реакцию при 30 миллилитрах холодного DMEM плюс 10% FCS.

Затем процедите смесь ткани и среды через сетчатое фильтр 70 микрон, помещенное поверх конической трубки объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте коническую трубку в течение пяти минут при 450-кратном G при четырех градусах Цельсия. Если мышам не проводили перфузию сердца PBS перед жертвоприношением, красные кровяные тельца в образце должны быть заморожены перед иммунным окрашиванием.

Клетки должны быть заблокированы для эндогенных ФК до мечения фибробластов и других клеточных популяций. Ресуспендируйте клетки в одном-трех миллилитрах факс-буфера, а затем добавьте блок FC в разведении от одного до 50, инкубируйте на льду от 10 до 20 минут. Нет необходимости смывать блок FC переносом 100 микролитровых аликвот ячеек на пробирки для использования в качестве неокрашенного контроля и одноцветного контроля.

В зависимости от количества флуоресцентных антител, использованных в данной демонстрации, два флуоресцентных антитела будут использоваться для мечения фибробластов на рецепторе альфа против PDGF. Он непосредственно конъюгируется с флюористым слоем в разведении от одного до 50 к сортировочному образцу, а также с контрольными элементами одного цвета для маркировки других клеточных популяций. Добавляйте соответствующие флуоресцентно конъюгированные антитела к поверхностным маркерам также в разведении от одного до 50.

Рекомендуется добавлять антитела также в соответствующие одноцветные контрольные пробирки, включая антитела к иммунным клеткам и эпителиальным клеткам, чтобы исключить любые двойные положительные популяции и, таким образом, повысить чистоту выделенных фибробластов. Затем инкубируйте клетки с антителами в течение одного часа на льду в темноте, после часа промойте клетки, заполнив пробирки факс-буфером номер один и вращая в течение пяти минут при 450-кратном перегрузке при четырех градусах Цельсия, США аспират и резонатор сгибают клетки в буфере факса 1 до концентрации, наиболее подходящей для сортировки с помощью используемого факс-сортировщика. Перенесите меченые клетки в трубки для факса с фильтрующими крышками и фильтруйте ячейки в пробирки, чтобы предотвратить скопление клеток, комки, чтобы исключить мертвые клетки.

DPI для всех образцов, кроме неокрашенного контроля. Держите образцы на льду во время анализа факса. Чтобы начать эту процедуру, используйте программное обеспечение для сортировки фактов для подготовки настройки флуоресценции, регистрации и настройки гидродинамической капли.

каждый образец в вихрь для ресуспендирования клеток перед загрузкой в сортировщик клеток. Начните с анализа неокрашенного образца, чтобы установить стробирование для общей популяции клеток, чтобы удалить клеточный мусор и определить автофлуоресценцию или фоновое окрашивание. Затем проанализируйте неокрашенный образец плюс DPI, чтобы определить и выделить популяцию живых клеток из общей популяции клеток.

Анализируйте каждый отдельный элемент управления цветом для определения и калибровки таких параметров, как компенсация. Проанализируйте образец пятна, чтобы определить положение ворот для сортировки. После того, как параметры и ворота для желаемых клеточных популяций установлены, начните сортировку меченых клеточных популяций в пробирки с PH или конические пробирки объемом 15 миллилитров, содержащие питательную среду или буфер для лизиса РНК.

Сразу после завершения сортировки отверждайте клетки вниз и перенесите их в свежую среду или буфер для лизиса РНК. В зависимости от цели вашего эксперимента, если фибробласты должны быть отсортированы, всегда наносите их на пластины с коллагеновым покрытием, а не непосредственно на пластик, так как это приведет к активации фибробластов, что приведет к изменению экспрессии их генов. Использование альфа-рецептора PDGF в качестве маркера для фибробластов приводит к выделению, высокообогащению популяций тканевых фибробластов.

В этом примере суспензии одиночных клеток молочных желез мыши окрашивали антителами альфа рецептора PDGF и 4 антителами F 80. График сортировки фактов показан на левой панели, где P two — ворота фибробластов, а P four — ворота макрофагов. Был проведен пост-исходный анализ для определения чистоты отсортированных фибробластов, показанных на правой панели, и макрофагов, показанных на средней панели.

На следующем рисунке показан анализ чистоты источников по Q-R-T-P-C-R специфических для клеток контрольных генов фибробластов, иммунных клеток и эпителиальных клеток. Результаты были нормализованы по двум домашним генам, ga, DH и mgus, и относительная экспрессия по gap. Показано, что DH обычно показывает загрязнение от 0,1 до 0,6%.

Такой уровень чистоты позволяет проводить высококачественное транскриптомное профилирование выделенных фибробластов. Количественная оценка экспрессии альфа-рецептора PDGF в несортированной популяции фибробластов молочной железы показывает, что примерно 85% от общего числа тканевых фибробластов в молочных железах являются альфа-положительными рецепторами PDGF. Я изолировался.

Фибробласты можно культивировать сразу после сортировки, но для восстановления может потребоваться несколько дней. Все дальнейшие эксперименты необходимо проводить с клетками с низким уровнем массажа, так как первичные фибробласты стареют во время размножения. В культуре, как только вы освоите эту технику, ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно.

Если третьи клетки предназначены для культивирования, их импортируют, чтобы не забыть о выполнении всей процедуры в стерильных условиях. В этой съемке мы не проводили стерильную сортировку. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить высокообогащенную популяцию фибробластов из свежей ткани.