Microgavage из личинки данио рерио

Общая цель данной процедуры заключается в пероральном введении веществ в просвет кишечника личинок zebrafish. Сначала личинок анестезируют и помещают на форму для инъекций, выстланную метилцеллюлозой. Затем личинок осторожно погружают в форму и выравнивают их относительно угла наклона зонда для зондирования и микроманипулятора.

Затем игла вводится в рот личинки и перемещается в кишечную луковицу. После достижения нужного положения материал вводится в просвет. Заключительным этапом является извлечение личинки из метилцеллюлозы и помещение её в свежую среду для восстановления после анестезии.

В конечном счете этот метод может быть использован для доставки материалов непосредственно в просвет кишечника личинок zebrafish, что позволяет изучать транспорт веществ внутри кишечника или в внекишечных тканях. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как погружение в воду с содержанием интересующего вещества, является возможность строгого контроля количества вводимого в организм материала, а также времени введения и дозировки. Это снижает экспериментальную вариабельность и в некоторых случаях токсичность, связанную с определенными материалами.

Идея этого метода возникла у нас из-за трудностей при применении некоторых флуоресцентных зондов в концентрациях, достаточно высоких для их обнаружения в эпителии кишечника с помощью микроскопии. Высокие концентрации иногда приводят к гибели рыб, при этом флуоресцентный сигнал все равно остается недостаточно сильным для визуализации. Для начала изготовьте несколько игл для зондирования, используя вытягиватель микропипеток и заготовки капилляров из кварцевого стекла.

Переместите образец под стереомикроскоп, чтобы обрезать иглы. Сначала совместите кончик иглы с краем прозрачной линейки или графика. После совмещения с помощью часовых пинцетов с тонкими кончиками обрежьте иглу примерно в одном миллиметре от кончика.

Рассмотрите кончик иглы при 100-кратном увеличении. Диаметр иглы должен составлять примерно 27–30 мкм, а кончик должен быть тупым. Для получения более стабильных результатов следует избегать использования острых или зазубренных игл.

Микрокузница может быть использована для более точного контроля формы кончика иглы и ее огневого полирования. Удалите острые края. Затем приготовьте раствор для зондирования.

Для большинства применений добавляют феноловый красный, чтобы облегчить визуализацию микроинъектора и определение места введения раствора для зондирования. После заполнения минеральным маслом установите иглу для зондирования в устройство для микроинъекций nano jet two. Оберните пластиковую чашку Петри диаметром 10 сантиметров биопленкой, чтобы создать плоскую водонепроницаемую поверхность, и нанесите на парафильм аликвоту раствора для зондирования объемом около двух микролитров.

Следующим шагом является ручное заполнение иглы для зондирования. Будьте осторожны, чтобы в минеральное масло не попали пузырьки воздуха. Чтобы откалибровать объем выброса, вводите маленькие капли в небольшую чашку Петри, наполненную минеральным маслом, пока они не станут однородными по размеру; измерьте диаметр капель с помощью графического метода и рассчитайте объем капли.

Здесь представлен график согласованности между иглами. Перед использованием иглы для зондирования удалите остатки минерального масла, промыв ее в чистой среде для рыб-зебра. После нагрева формы Aros закройте три желоба 3% метилцеллюлозой. Желоб должен быть покрыт в объеме, достаточном для удержания рыбы, но не настолько малом, чтобы метилцеллюлоза быстро высыхала.

Затем распределите по 4 мл среды для данио-рерио в лунки шестилуночного планшета и перенесите личинок zebrafish каждой экспериментальной группы в отдельные лунки. Для анестезии рыб приготовьте 3-кратный раствор трикаина в соответствующей среде для данио-рерио. Добавляйте раствор в лунки по очереди.

Анестезируйте рыб, добавив в среду равный объем раствора трикаина и осторожно перемешав содержимое круговыми движениями. Как только рыбы перестанут двигаться, с помощью широкой пастеровской пипетки поместите их по одной на метилцеллюлозу так, чтобы их головы находились под углом 45 градусов к желобку, а хвосты были направлены к углу 90 градусов. С помощью тупого препарировочного зонда осторожно прижмите каждую личинку к метилцеллюлозе, чтобы стабилизировать их положение.

Затем отрегулируйте установку для микроинъекций NanoJet II так, чтобы игла была наклонена под небольшим углом. Убедитесь, что диапазона выдвижения будет достаточно, чтобы достичь дна лунки. Чтобы свести к минимуму необходимость в дальнейших регулировках, установите блок микроинъекций на выпуск 4,6 nanoliters, используя режим медленного впрыска (slow inject); одной рукой выполняйте небольшие смещения планшета с иммобилизованными личинками, а другой управляйте микроманипулятором блока микроинъекций.

Как правило, новичкам в этом методе бывает трудно, так как рыбки-зебры очень малы и легко повреждаются. Требуется практика, чтобы распознать структуру пищевода под стереомикроскопом и определить подходячную силу нажатия на иглу для зондирования, чтобы достичь просвета кишечника. Сначала осторожно введите иглу для зондирования в рот анестезированной рыбки.

Пройдите через пищевод и слегка надавите на пищеводный сфинктер, чтобы ввести кончик инструмента непосредственно за переднюю стенку кишечника. Оказавшись в передней луковице, осторожно введите материал с данными настройками. Введенный объем должен быть достаточным для заполнения передней луковицы кишечника, не допуская утечки через пищевод или клоаку.

Быстро и плавно извлеките иглу. Следите за тем, чтобы в пищевод не попало значительное количество материала. После извлечения зонда перенесите рыбу в чашку со свежей средой.

Выведите личинок из состояния анестезии и удалите метилцеллюлозу, несколько раз промыв их в свежей среде. Перенесите личинок в чашку Петри или планшет на шесть лунок до начала использования. Для последующего анализа можно использовать микрозондирование (микрогаваж) для введения различных материалов в организм подопытных рыбок данио-рерио.

Для начала подготовьте необходимые растворы для зондирования, чтобы продемонстрировать данный метод. Для анализа целостности барьера кишечного эпителия используется 10 KD декстран, конъюгированный с Texas Red.

Следуя описанным ранее этапам, проведите зондирование групп от 10 до 20 личинок zebrafish для каждого экспериментального условия. По возможности повторите процедуру в двух или трех повторностях. После зондирования выведите личинок из состояния анестезии и перенесите их в свежую среду для свободного плавания.

Примерно через 20 минут повторно проведите анестезию личинок, как было показано ранее. После анестезии поместите личинок в 3% раствор метилцеллюлозы на блок из 3% агарозы. Сфотографируйте личинок с помощью флуоресцентного стереомикроскопа с фильтром Texas red, выбрав такое увеличение, при котором личинки будут видны от носа до области непосредственно за концом клоаки. Флуоресценция в просвете кишечника должна быть интенсивной.

Однако барьерная функция оценивается по уровню декстрана, который появляется в внекишечных тканях; отрегулируйте экспозицию, чтобы обеспечить визуализацию флуоресценции туловища. Даже если при самостоятельном введении это приводит к переэкспозиции люминальной флуоресценции, декстран удерживается в просвете кишечника. Однако у личинок, совместно введенных с EDTA, которая нарушает плотные контакты эпителия, декстран обнаруживается в кровотоке, а также в мезотелиальных сосудах и пространствах.

В данных примерах программа Image J использовалась для количественного определения относительной средней флуоресценции в области интереса (ROI) в туловище рыбки данио-рерио с нормализацией по ROI вне организма рыбки в качестве внутреннего контроля. Здесь результаты использования обычной иглы сравниваются с результатами использования иглы, изготовленной на микрокузнице. В группе, получавшей только декстрин, меньшее количество личинок имело внекишечную флуоресценцию, что свидетельствует о меньшей вероятности повреждения личинок при использовании игл, изготовленных на микрокузнице.

При более детальном рассмотрении одного из участков видно, что декстран снова ограничен просветом кишечника и не проникает в сосуды или внекишечные пространства. В отсутствие EDTA, при одновременном введении с EDTA, декстран обнаруживается во внекишечных пространствах, а также в просвете дорсальной аорты и задней кардинальной вены; сигнал крови в данных областях обусловлен кровотоком. При выполнении этой процедуры убедитесь, что игла не имеет зазубрин, что рыбки надежно и правильно зафиксированы в метилцеллюлозе, а также будьте осторожны и терпеливы, осваивая технику проведения иглы через пищевод личинки.

Этот метод может быть использован в широком спектре приложений на моделях zebrafish, требующих контролируемого введения или визуализации материалов в кишечнике. Он обеспечивает строгий контроль за временем, путем и дозировкой доставки веществ в организм животного, что значительно снижает вариабельность как внутри одного эксперимента, так и между разными экспериментами.