Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы пометить и захватить пять гидроксиэтилцитокинов, недавно обнаруженную модификацию ДНК, сначала фрагментировать геномную ДНК с помощью ультразвука, а затем выполнить реакцию бета-глюкозной трансферазы для переноса азидных глюкозных фрагментов на пять остатков гидроксиэтилцитидина на ДНК с использованием химии Qlik. Присоедините к группе Азид салидный биотин-линкер для получения биотинилированной ДНК. Затем селективно захватывают пять фрагментов ДНК, содержащих гидроксиэтилцитидин, на шариках стрептавидина независимым от плотности образом.

Очищенные пять фрагментов ДНК, обогащенных гидроксиэтилцитидином, могут быть использованы для последующих анализов, включая секвенирование нового поколения. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующим подходом, таким как подход, основанный на антителах, заключается в том, что захват phy гидроксиэтилцитозина не зависит от плотности PHY C. Юджин Ли, старший научный сотрудник лаборатории, продемонстрирует этот протокол.

Во-первых, произведите ультразвуковую обработку геномной ДНК до диапазона размеров, подходящего для полногеномной платформы секвенирования. Проверьте распределение по размерам фрагментированной геномной ДНК на геле с 1%-ной кислотой. Теперь определите начальное количество ДНК на основе обилия пяти гидроксиэтилцитабина в геномной ДНК.

Поскольку пять гидроксиэтилцитабинов значительно варьируют в разных тканевых пункциях, исходное количество DN будет зависеть от уровня пяти C образцов. Примеры см. в таблице 1 в рукописи. Первым этапом процесса мечения является основная реакция переноса AZA глюкозы Es к пяти остаткам C на фрагментированной геномной ДНК.

Соедините компоненты реакции и перемешайте с помощью пипетирования, затем инкубируйте ферментную реакцию на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. На один час. Пропустите реакцию через набор для быстрого удаления нуклеотидов на каяке, используя 10 микрограммов ДНК на колонку, ДНК с 30 микролитрами воды на колонку и вытащите образцы на втором этапе процесса маркировки.

Я салифицирую, что линкер bing присоединен к группе eza с помощью клик-химии. Для реакции подъема биотина добавьте пять микролитров рабочего раствора конъюгата биотина на 30 микролитров раствора ДНК. Выдерживать на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.

Обработайте реакцию с помощью каяка, набора для быстрого удаления нуклеотидов и разведите ДНК в 100 микролитрах. Затем количественно оцените восстановленную ДНК с помощью NanoDrop. Начните с 50 микролитров шариков стрептококка adin dyna.

Выполните три стирки в соответствии с инструкциями производителя и соберите бусины на магнитной подставке. Теперь разбавьте биотинилированную ДНК 100 микролитрами двукратного BNW буфера и добавьте образец к промытым шарикам. Выдерживать в течение 15 минут при комнатной температуре при щадящем вращении.

Соберите бусины с помощью магнитной подставки и трижды постирайте рядом с элюированием ДНК. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленного 50 миллимолярного DTT и инкубируйте при комнатной температуре при щадящем вращении в течение двух часов. Отделите бусины с помощью магнитной подставки.

Затем соберите EENT, содержащий целевую ДНК, и загрузите образец в микробиологическую колонку со спином шести. Чтобы удалить DTT, дополнительно очистите образец на когенной колонке и элюируйте ДНК в 10 микролитрах буфера EB, количественно оцените ДНК с помощью кубита, флуориметра или NanoDrop. Если концентрация выше 20 нанограммов на микролитр, то этот 1%-ный гель показывает обработанные ультразвуком фрагменты ДНК, выделенные из IPS-клеток человека.

Для последующих приложений, таких как секвенирование нового поколения, типичный размер фрагментации составляет около 300 пар оснований. Обратите внимание, что при высоком качестве геномной ДНК выход восстановления после реакций бета-GT и биотина составляет от 60 до 70%. Как правило, эффективность захвата геномной ДНК мозга составляет от 4 до 9%, а в некоторых крайних случаях эффективность может достигать 12%Для ES-клеток средняя эффективность захвата составляет от 2 до 4%, в отличие от примерно 0,5%Для нейронных стволовых клеток самый низкий дефицит наблюдался до сих пор для геномной ДНК из раковых клеток.

После этих процедур могут быть применены другие методы, такие как метод секвенирования следующего поколения, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как распределение пяти модификаций GC по всему геному.