Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Метод, показанный в этом видео, использует карты судьбы эмбриона на стадии расщепления opus для идентификации культуры одного блейзера изолированно, чтобы оценить, определяется ли сульфат эмбриона внутренними или внешними инструкциями, сначала собираются два клеточных эмбриона, в которых первая борозда расщепления делит пополам слегка пигментированную область полушария животного. Эти эмбрионы культивируют, когда эмбрионы достигают от 16 до 32 клеток, затем удаляют вительную мембрану и рассекают соседние клетки вдали от выбранной клетки. Для пояснения расчлененный бластер затем перемещается в углубление в культуре, покрытой шнеком, хорошо и культивированной.

После того, как эксплан достигает желаемой стадии, его собирают для оценки экспрессии генов или белков с использованием гибридизации in situ, QPCR или иммуногистохимии. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими, такими как культивирование, большие группы эмбриональных клеток или орган при входе в систему, заключается в том, что одиночные эмбриональные богохульники, судьба развития которых известна из исследований по отслеживанию родословной, могут быть культивированы без добавления факторов роста или присутствия соседних клеток. Таким образом, можно непосредственно проверить, являются ли факторы, присущие клетке, предписывающими этому богохульству стать предшественником определенной ткани, или же ему требуются сигналы от окружающих клеток.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как вскрытие Блэра и перенос их в культуральные лунки требует тонких манипуляций под стереомикроскопом. В этом видео я буду использовать этот метод, чтобы продемонстрировать, смещают ли материнские мРНК клетки в сторону нейронной судьбы, работая под микроскопом вскрытия. Заточите четыре комплекта щипцов с помощью абразивной пленки Illumina.

Одна пара щипцов служит резервной на случай, если наконечник будет поврежден во время процедуры, автоклавируют все четыре щипца и хранят в стерильном контейнере, вносят по 500 миллилитров в каждый из 0,1 х и 1,0 х модифицированного бартового раствора или MBS и фильтруют их стерилизуя. Храните эти растворы при температуре от 14 до 18 градусов Цельсия в течение нескольких месяцев в стеклянной бутылке с завинчивающейся крышкой, приготовьте 2%-ный электрофорез в 100 миллилитрах одной Х-культуры. Средний автоклав для растворения ароса в микроволновой печи, для разжижения ароса при следующей необходимости, пока арос жидкий.

Вылейте около 0,5 миллилитров на дно каждой лунки стерильной 24-луночной питательной пластины. Это предотвратит прилипание имплантатов к пластику. Затем налейте около двух-трех миллилитров на дно двух-360-миллиметровых чашек Петри и аккуратно перемешайте, чтобы распределить.

Они будут служить посудой для вскрытия, а арос предотвращает прилипание эмбрионов к пластику. После того, как их мембраны будут удалены, когда арос остынет и затвердеет пламя, кончик шестидюймовой пастбищной пипетки до тех пор, пока он не превратится в шар. Кратко оформите шар, затем слегка прикоснитесь им к поверхности ароса в лунке тарелки для культивирования.

Это создаст неглубокое углубление, в которое будет помещен X-образный план. Повторите для каждой лунки в тарелке. Затем заполните каждую лунку питательной пластины одним миллилитром одной х стерильной питательной среды.

Затем наполните чашку для препарирования 0,1 XMBS для облегчения разделения бластера. После того, как чашки для вскрытия будут приготовлены, перенесите оплодотворенные яйца с удаленной медузной оболочкой в 100-миллиметровые чашки Петри, содержащие 0,5 x питательную среду. Те из них, которые не используются сразу, могут быть культивированы при температуре 14 градусов Цельсия, в то время как первая чашка исследуется на наличие двух клеточных эмбрионов.

Рассмотрите эмбрионы в первой чашке Петри с помощью диссекционного микроскопа с помощью пластиковой трансферной пипетки, перенесите около 101 клеточного и двух клеточных эмбрионов в отдельную чашку, заполненную 0,5 х культурой. Терпимая. Поместите чашку Петри в инкубатор с температурой 14 градусов Цельсия. Способность этого анализа точно оценить потенциал развития клетки зависит от анализа правильного богохульства на основе карт судьбы.

Поэтому очень важно выбирать эмбрионы с правильным рисунком пигментации на двухклеточной стадии, которые впоследствии соответствуют регулярным моделям расщепления. Как показано здесь. Регулярные расщепления часто происходят только с одной стороны эмбриона.

Эти эмбрионы все еще могут быть использованы в качестве доноров, если донорская клетка происходит с обычной стороны. Когда эмбрионы достигнут двухклеточной стадии, отсортируйте те, в которых первая борозда расщепления делит пополам слабо пигментированную область в полушарии животного в отдельную чашку, отсортируйте примерно в пять раз больше эмбрионов, чем будет рассечено. Они будут донорами для объяснения.

Храните оставшиеся два клеточных эмбриона в отдельной чашке рядом с донорскими эмбрионами на протяжении всей процедуры, чтобы они служили в качестве контрольной группы для этапа исследования. После того, как эмбрионы будут отсортированы и препарированы, вернитесь к чашкам в инкубаторе, чтобы найти еще одноклеточные и двухклеточные эмбрионы. Поскольку для деления эмбрионов одной клетки требуется около 90 минут, это можно сделать в течение двух часов после сбора яйцеклеток.

Чтобы приготовить эксплан, поместите от пяти до 10 эмбрионов в чашку для вскрытия. Затем расположите первый эмбрион так, чтобы прозрачная вительная мембрана могла быть захвачена щипцами. Обычно его нельзя увидеть, но его можно схватить на животном полюсе, где он отделен чистым пространством над поверхностью эмбриона.

С помощью заточенных щипцов в одной руке возьмитесь на расстоянии от бластера, который необходимо рассекать, чтобы не повредить его. Затем с помощью заостренных щипцов в другой руке возьмитесь за мембрану близко к кончику других щипцов и осторожно потяните в противоположных направлениях, чтобы снять мембрану. Эмбрион станет сплющенным после удаления оболочки.

Далее захватите соседнюю клетку щипцами и используйте эту клетку как ручку так, чтобы рассекаемая клетка не касалась напрямую щипцами в другой руке, аккуратно оттягивайте оставшиеся соседние клетки подальше от желаемого богохульства. Если мишенью являются клетки средней линии, которые имеют одну и ту же судьбу, они могут быть удалены вместе как пара. Наконец, рассекаем ручку клетки.

Возьмите в руки пару богохульства или амер стерильным стеклом мимо пипетки, избегая образования пузырьков воздуха и чрезмерного всасывания. Поместите кончик пастбищной пипетки под поверхность питательной среды в лунку чашки для культуры X explan и осторожно выдавите бластер. Он должен сползать в неглубокую впадину под действием силы тяжести.

Богохульники из более чем одного эмбриона могут быть объединены в один и тот же эксплан, поместив их в одно и то же углубление в культуре. Что ж, повторите эту процедуру с оставшимися в чашке для вскрытия эмбрионами по одному. Примерно через 10 эмбрионов чашка для вскрытия будет заполнена клеточным мусором.

Когда это произойдет, перекиньтесь на следующую чашку для вскрытия. После того, как все вскрытия будут сделаны, проверьте, находятся ли экспланиры в неглубоких углублениях. Если нет, их можно аккуратно протолкнуть в углубление с помощью петли для волос, стерилизованной в 70% этаноле, и высушенных на воздухе инкубировать имплантаты при комнатной температуре на скамейке примерно через час после последнего вскрытия.

Удалите мусор вокруг зажившего эксплана с помощью стерильного стеклянного пастбищного пипетки. Пластина эксплана при температуре от 14 до 20 градусов Цельсия рядом с чашкой Петри, содержащей контрольные эмбрионы братьев и сестер. Эмбрионы братьев и сестер будут указывать на стадию развития причины богохульства.

Примерно через один-два часа в культуре эксплантированные бластомеры разделятся примерно в четыре раза и отслоят большую часть мусора, оставшегося от поврежденных соседних клеток. Через 20 часов они образуют небольшие крепкие шарики из ячеек. Когда братья и сестры достигнут желаемой стадии развития, соберите урожай.

Эти средства приживаются довольно хорошо, даже если часть клеток распадается. Поэтому, если в культуре есть мутная масса, хорошо исследуйте ее с помощью петли для волос или щипцов, чтобы определить, не зарыт ли в нее здоровый эксплан. Возьмите экстракт в небольшом объеме питательного раствора стаканом мимо пипетки и аккуратно вытолкните их в фиксирующий или лизисный буфер, подходящий для проводимого анализа.

Два дорсальных богохульника или два вентральных богохульника были препарированы на 16-клеточной стадии и культивировались в одном XMBS при 14 градусах Цельсия до тех пор, пока эмбрионы братьев и сестер не достигали ранних стадий нервной пластинки. Каждый образец был проанализирован на экспрессию зиготической нервной пластинки. Ген Sox два путем гибридизации in situ, которая рассматривается как синий продукт реакции.

Результаты этого анализа показывают, что большинство богохульников спинных животных, которые являются предшественниками нервной пластинки, могут экспрессировать SOX 2 автономно. То есть без дополнительной сигнализации со стороны других участков эмбриона. Те экспланы, которые не экспрессируют SOX 2, могли быть неправильно идентифицированы во время вскрытия.

В отличие от этого, ни один из вентральных богохульников животных, которые являются предшественниками вентрального эпидермиса, не экспрессирует SOX 2. Эти данные указывают на то, что спинные животные богохульники обладают врожденной способностью формировать нервную ткань, в то время как брюшные животные богохульники этого не замечают. Некоторые из дорсальных выемок также имеют удлиненную морфологию, указывающую на формирование дорсальной мезодермы.

Эти бластомеры также выцветают с образованием Noor в интактном эмбрионе, и эксплан-культура экспрессирует маркерный белок Noor для проверки эффекта изменения эндогенных уровней экспрессируемого у матери нейронного гена. Fox D ввели пять мРНК восьми клеточным вентральным предшественникам-богохульникам. Как показано на рисунке, большинство вентральных имплантатов экспрессировали SOX 2.

И наоборот, когда эндогенный уровень Fox D 5 был снижен путем инъекции олигонуклеотидов антисмысловой морфы в восьмиклеточные дорсальные предшественники-предшественники, только несколько дорсальных экспланов экспрессировали SOX 2. Эти эксперименты показывают, что материнская экспрессия Fox D 5 играет роль во внутренней способности дорсальных богохульников приобретать нейронную судьбу до этой процедуры. Для ответа на дополнительные вопросы могут быть выполнены другие методы, такие как введение в препарируемые организмы Блэра либо мРНК для усиления функции, либо антисмысловых морфооолигонуклеотидов для потери функции.

Например, какие гены участвуют во внутренней способности клеток вызывать определенную судьбу развития? Кроме того, можно проверить известные сигнальные факторы путем добавления очищенных факторов в питательную среду. Этот подход также может быть использован для трансплантации отдельных богохульников в новые места в интактном эмбрионе.

Эта информация имеет решающее значение для определения клеточных механизмов, с помощью которых плюрипотентная эмбриональная клетка становится предшественником определенной ткани.