Одновременное Цельноклеточная Записи из фоторецепторов и второго порядков Нейроны сетчатки амфибий Подготовка Slice

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить тонкие срезы ткани из сетчатки водной тигровой саламандры и использовать их для одновременной записи напряжения от фоторецепторов и горизонтальных и биполярных клеток второго порядка. Это достигается путем препарирования глаза саламандры и изоляции сетчатки на кусочке нитроцеллюлозной мембраны. Второй шаг — вырезать тонкие срезы сетчатки и поместить их в камеру записи.

Затем камеру помещают на вертикальный микроскоп с неподвижным предметным столиком, а патч-пипетки располагают над срезами сетчатки. Последним шагом является получение записей всей клетки от пресинаптической, фоторецепторной и постсинаптической горизонтальной или биполярной клетки. В конечном счете, парные записи целых клеток могут быть использованы для манипулирования синаптическим высвобождением и изучения взаимодействий между клетками сетчатки.

Препарат среза сетчатки был первоначально разработан в лабораториях Франка Верблина и Сэма Ву.В отличие от препаратов одиночных клеток, препараты среза сохраняют неповрежденный контакт, и в отличие от препаратов целой сетчатки, срез сетчатки обнажает различные слои сетчатки, обеспечивая легкий доступ ко всем различным типам клеток. В срезе сетчатки. Препараты могут быть использованы для электрофизиологической регистрации, в том числе для одновременной регистрации нескольких клеток и для экспериментов по визуализации.

Этот препарат оказался чрезвычайно ценным для изучения синаптических взаимодействий между нейронами сетчатки. В этом видео мы расскажем о приготовлении срезов с помощью сетчатки тигровой саламандры и подчеркнем некоторые мелкие детали, которые могут сделать разницу между успехом и неудачей. Начните эту процедуру со сборки камеры.

Поместите две бусины вакуумной смазки, расположенные на расстоянии от восьми до 10 миллиметров друг от друга, поперек записывающей камеры, чтобы сформировать канал для суперфаза, и внедрите ломтики ретинола на второй взлет смазки, на несколько миллиметров выше каждой из этих двух бусин смазки, чтобы они действовали как сборщик для ограничения распространения. Затем поместите небольшой треугольный кусочек салфетки Кима в конец камеры, чтобы обеспечить контакт жидкости с электродом сравнения. После этого прижмите кусочек нитроцеллюлозной мембраны плашмя к стеклянному микроскопу.

Наденьте на две маленькие бусины вакуумной смазки. Для приготовления ткани слайсером. Разломайте обоюдоострое лезвие бритвы на четыре части.

Затем прикрепите один из них к руке для нарезки. Убедитесь, что режущая кромка лезвия бритвы прилегает ровно к записывающей камере, разрезав тонкий ломтик нитроцеллюлозной фильтровальной бумаги. Далее, после усыпления саламандры путем обезглавливания, зародышев глаз с помощью пары маленьких венецианских ножниц под микроскопом, разрежьте кожу, которая соединяет глаз с окружающей орбитой.

Затем потяните глаз вперед и просуньте под него ножницы, чтобы разрезать глазные мышцы и зрительный нерв. После этого поместите энуклеированный глаз на ватную подушку на линолеуме. Теперь сделайте небольшой разрез в центре роговицы острым хирургическим лезвием.

Удалите роговицу, вставив тонкие ножницы «Венеция» в разрез и расширив разрез радиально по направлению к зубчатой ауре. Затем разрежьте по окружности вокруг пильчатой ауры, вращая блок линолеума или вату между разрезами. После разреза по всему периметру глаза удалите роговицу и хрусталик, вытащив их из боковой части наглазника.

Перенесите оставшийся наглазник на твердую поверхность линолеума, смоченную солевым раствором амфибий. Разрежьте его на три части острым лезвием бритвы тонкими пилящими движениями, чтобы убедиться, что он разрезает склеру по всей длине. Затем поместите один или два кусочка IUP на нитроцеллюлозную мембрану поверхностью сетчатки вниз.

Погрузите оставшиеся кусочки в дополнительный физиологический раствор. После этого поместите их в холодильник на случай, если позже будут нарезаны дополнительные ломтики. Теперь аккуратно прижмите кусочек IUP к нитроцеллюлозной мембране с помощью пары тонких щипцов.

Погрузите нитроцеллюлозную мембрану и кусочек IUP в несколько капель холодного раствора амфибий. Затем слейте солевой раствор, прикоснувшись к кусочку Кима, протрите по краям нитроцеллюлозную мембрану и вьте. После этого погрузите ИУП в нитроцеллюлозную мембрану с несколькими каплями холодного солевого раствора амфибий.

Опять же, впоследствии отшелушите склеру сосудистой оболочки глаза, пигментный эпителий сетчатки, чтобы изолировать сетчатку. Если сетчатка не прилегла плотно, слейте физиологический раствор с помощью салфетки. Для того чтобы более плотно притянуть сетчатку к нитроцеллюлозной мембране, замените физиологический раствор и при необходимости повторите процедуру.

Далее заполните камеру холодным солевым раствором амфибий. Перенесите его на стадию слайсера для тканей. Затем разрежьте сетчатку и нитроцеллюлозную мембрану на тонкие полоски размером 125 микрон, осторожно, но сильно продавливая лезвие бритвы.

Разрезав всю сетчатку на срезы, перенесите срезы сетчатки один за другим в основной канал записывающей камеры. Чтобы перенести ломтик, удерживайте полоску мембраны на месте, одновременно сдвигая камеру под ней. Обязательно держите ломтик погруженным, когда он находится над центральной частью камеры.

Заделайте края нитроцеллюлозной мембраны в полоски вакуумной смазки и поверните ее на 90 градусов. Чтобы рассмотреть слои сетчатки, прижмите нитроцеллюлозную мембрану к поверхности стекла, даже если на каждом кусочке нет сетчатки. Размещайте полоски нитроцеллюлозной мембраны с равными интервалами около миллиметра, чтобы помочь разрушить поверхностное натяжение и тем самым улучшить поток жидкости.

Продолжайте перекладывать ломтики один за другим, пока срезы не будут размещены по всей длине перфузионного канала. После того, как все срезы будут перенесены, переместите записывающую камеру на столик вертикального микроскопа с неподвижным столиком. Подсоедините электрод сравнения к проводу заземления на головном каскаде усилителя.

Сосредоточьтесь на срезах с помощью объектива с большим рабочим расстоянием и погружением в воду от 40 до 60 раз. Следующий супер. Сплавляйте ломтики со скоростью один миллиметр в минуту с солевым раствором амфибий, пузырчатым с кислородом.

Подсоедините всасывающую линию к выходной линии камеры. Затем отрегулируйте отток, чтобы сбалансировать приток, вращая скошенный конец всасывающей иглы или перемещая салфетку kim в конце камеры ближе или дальше от отверстия на кончике иглы оттока. Осмотрите ломтики под тусклым или инфракрасным светом.

Затем определите пару клеток, фоторецептор и ближайшую горизонтальную или биполярную клетку для оптовой продажи. Записывая пипетку Филиппа, подготовленную перед началом экспериментов с внутриклеточным раствором, закрепите ее на электрододержателе. Затем слегка поднимите объектив микроскопа.

Расположите фоторецепторную пипетку под объективом. Затем опустите его так, чтобы кончик располагался чуть выше среза, и одновременно отрегулируйте фокус. Чтобы не перегнуть палку.

Повторите эту процедуру со второй пипеткой. Затем проверьте сопротивление пипетки с помощью деполяризующего импульса от пяти до 10 милливольт. Отрегулируйте любое смещение базового уровня тока на усилителе.

После этого приложите небольшое положительное давление, а тем временем расположите постсинаптическую пипетку так, чтобы она соприкасалась с горизонтальным или биполярным телом клетки. Затем расположите пресинаптическую пипетку так, чтобы она соприкасалась с клеточным телом фоторецептора палочки или колбочек. При контроле сопротивления высвобождения, положительного давления на постсинаптическую пипетку, иногда сброса положительного давления бывает достаточно для формирования гигаомного уплотнения.

После того как сопротивление наконечника увеличится до более чем 100 мега Ом, примените удерживающий потенциал минус 60 милливольт. Затем, когда будет получено уплотнение giga om, отмените переходный процесс емкости пипетки. Используя схему компенсации емкости усилителя с патч-клещей, повторите потолочную процедуру с фоторецепторной пипеткой, применяя удерживающий потенциал минус 70 мВ, и отмените емкость пипетки.

Переходный периодический, затем разорвите пластырь, применяя отсасывание к каждой клетке. Разрыв участка проявляется в том, что емкость всей ячейки является переходной. Теперь подтвердите физиологическую идентичность постсинаптической клетки, подав световую вспышку и подав ряд ступеней напряжения от минус 120 до плюс 40 милливольт с шагом 20 милливольт.

Чтобы оценить, связаны ли клетки синаптически друг с другом, подайте напряжение 60 милливольт в течение 25-100 миллисекунд. Пошаговая деполяризация к фоторецептору и поиск постсинаптических токов. В нейронах второго порядка представлены репрезентативные следы световых откликов нейронов в вертикальных срезах сетчатки саламандры.

Конусная горизонтальная ячейка и выключенная биполярная ячейка проявляют внешний ток в ответ на появление света. Заметный внутренний ток, следующий за световой вспышкой в горизонтальных и биполярных клетках, вызван повышенным высвобождением глутамата из фоторецепторов по мере их деполяризации при смещении света. Биполярная клетка реагирует внутренним током при появлении света, что является результатом сигнального каскада, инвертирующего метаботропный глутаматный рецептор, и активации трипм-1 каналов.

Горизонтальные и биполярные ячейки можно отличить друг от друга по соотношению напряжения тока. Горизонтальные ячейки обычно имеют отношение напряжения линейного или выпрямляющего внутрь тока с входным сопротивлением менее 500 мегаом, биполярные элементы имеют отношение напряжения выпрямляющего тока наружу и более высокое входное сопротивление от 0,5 до двух гигаОм. На этом рисунке показаны репрезентативные результаты записей пары горизонтальных клеток конуса и пары биполярных клеток колбочки.

В каждом случае деполяризация конуса до минус 10 милливольт от удерживающего потенциала минус 70 милливольт вызывала напряжение кальциевого тока в конусе и ускоряла внутренний постсинаптический ток. Ток в горизонтальной или биполярной клетке среза сетчатки. Препараты были использованы в сотнях исследований по анатомии и физиологии сетчатки.

Они особенно полезны для изучения реакции нескольких клеток одновременно, поскольку они облегчают запись и визуализацию нескольких клеток одновременно. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как препарировать сетчатку, вырезать тонкие срезы сетчатки, расположить их в камере записи и получить оптовые записи от пар синаптически связанных личностей.