LeafJ: Plugin ImageJ для полуавтоматического измерения формы листьев

Целью этой процедуры является автоматизация измерения формы листьев для высокопроизводительных экспериментов. Это достигается путем предварительного препарирования листьев и их визуализации с помощью планшетного сканера. Вторым шагом процедуры является использование плагина leaf J для обнаружения и измерения листьев.

Третий шаг – подготовка листьев к микроскопии и их фотографирование с помощью составного микроскопа. Последний шаг — обводить линии распродажи на полученных изображениях с помощью планшета с сенсорным экраном. В конечном счете, результаты могут показать различия в форме листьев, размере и количестве клеток благодаря этой комбинации анализа изображений.

Главным преимуществом данной методики перед существующими методами является ее быстрота. Это примерно в шесть раз быстрее, чем ручное измерение. Люди знали, что этот метод может быть сложным, потому что правильное размещение листьев имеет решающее значение для последующего анализа, а также потому, что установка листьев на предметные стекла может быть технически сложной.

Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я понял, что у нас есть около 15 000 листьев для анализа, и делать это вручную займет много месяцев и будет невероятно скучно, демонстрируя технику вскрытия растений, это вызовет нейрозу. Научный сотрудник из моей лаборатории Начните с подготовки прозрачных листов размером 8,5 на 11 дюймов. Каждый лист должен быть разделен на прямоугольные рамки, достаточно большие, чтобы вместить листья с одного растения, второй прозрачный лист сужается к напечатанному листу, чтобы он служил крышкой, предотвращающей высыхание листьев.

Этикетка с указанием растения, генотипа и условий роста. Рассеките листья растения 26-го дейника. Расположите листья на прозрачности в тактическом порядке от младшего к самому старшему.

Расположите листья вертикально в рамке, не касаясь бордюра и не перекрывая другие листья. В противном случае возникнут проблемы Во время анализа важно, чтобы восточные листья вертикально не соприкасались, обрамлялись, не перекрывались с расположенными листьями. Прослойте их вторым чистым прозрачным листом и решеткой, чтобы листья оставались плоскими.

Затем сгенерируйте изображение с помощью планшетного сканера с разрешением не менее 600 точек на дюйм. Начните с установки плагина. Загрузите изображение J и перетащите файл leaf jja в папку plugins изображения J. Когда используется изображение J, плагин leaf J теперь будет доступен.

Откройте файл конечного изображения на изображении J. Убедитесь, что изображение J имеет версию 1.45 s или более позднюю. Разделите изображение на три цветовых канала: красный, зеленый и синий, щелкнув разделенные цветовые каналы изображения. Далее примените порог к изображению в синем канале.

Теперь выделите все листья с одного растения с помощью инструмента прямоугольного выделения, а затем выберите плагин leaf J. Теперь плагин откроет окно, позволяющее задать различные условия эксперимента, такие как экспериментальная группа и генотип. Прежде чем продолжить, отредактируйте эти параметры, затем выберите условия для выбранных листьев в интересующей области и укажите описательное имя.

Нажмите «Продолжить», и leaf J автоматически обведет каждый лист уникальным изображением ROI. J подпрограммы подгоняются в эллипсе к лезвию и при необходимости рассчитывают большую и малую оси этого эллипса. Отредактируйте линии трассировки с помощью окна менеджера ROI.

Для этой процедуры может быть полезен планшет с сенсорным экраном, подключенный в качестве внешнего монитора. Правильно определив границы, выполните анализ нажатием кнопки мыши. Хорошо, теперь лист J выводит длину лепестка и различную геометрию листовой пластинки.

В конечном итоге, экспортируйте результаты измерений и связанную с ними информацию в электронную таблицу. Отсканировав листья, зафиксируйте их в F-A-A-F-A. Неподвижные листья могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия до шести месяцев.

За час или два до получения изображения листья очищаются, заменяя фиксатор FAA на раствор хлоргидрата. После очистки закрепите листья на предметных стеклах трихомами вверх, используя 40-кратное увеличение на изображении составного микроскопа, слой мезиля центра каждого листа по обе стороны от главной жилки, избегая клеток рядом с трихомами или жилками. Чтобы избежать трудностей при обработке изображений, важно удалить все пузырьки воздуха со слайдов при монтаже створок, а также получить изображения в фокусе на следующем этапе.

После сбора нужных изображений откройте одно из них на изображении J и обведите контуры ячеек листа с помощью инструмента менеджера JROI с помощью сенсорного планшета и стилуса. При этом не используется плагин LEAF J. До использования LEAF J для экспериментов точность и скорость плагина сравнивались с точностью и скоростью работы опытного исследователя. Полный.

Leaf J показал результат 5,7 быстрее, чем ручные расчеты, и сравнение данных двух методов показало, что результаты тесно коррелируют по всем измеренным параметрам из 3 532 сравниваемых. Точки данных 172 были выбросами. Из этих выбросов 29 были вызваны плагином LEAF J, что намного меньше, чем 143, вызванных человеческой ошибкой.

С тех пор во время ручного измерения лист J был обновлен, чтобы еще больше уменьшить количество ошибок. Основываясь на измерениях LEAF J, он был использован для определения избегания затенения с помощью модели смешанных эффектов. Обработка и количество листьев были фиксированными эффектами, а повторение было случайным эффектом.

На многие параметры существенно повлияла обработка затенением. С другой стороны, на некоторые параметры тень существенно не влиял. С помощью таблетированного визуализированного анализа клеточных параметров были исследованы 67 генотипов Arabidopsis ANA, в общей сложности 8 629 клеток из 877 листьев 224 растений.

Затем генотипы были сгруппированы в шесть классов. Большинство генотипов имеют нормальный размер и количество клеток. Тем не менее, некоторые из них имели больший размер клеток при нормальном количестве клеток.

Несмотря на то, что при выращивании растений важно использовать рандомизацию и экспериментальный дизайн, помните, что работа с формальдегидом и хлоргидратом может быть чрезвычайно опасной. Поэтому при выполнении этой процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и работа в вытяжном шкафу. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить высокопроизводительный скрининг фенотипов листьев и клеток с использованием ваших собственных экспериментальных условий.

Дополнительные методы, такие как секвенирование РНК, могут быть использованы для ответа на такие вопросы, как то, какие гены эффективно формируются.