Местное применение наркотиков по изучению никотиновых рецепторов ацетилхолина функции в срезах мозга мыши

Общая цель этой процедуры заключается в изучении функции лиганд-зависимых ионных каналов в нейронах из остро подготовленных срезов мозга, полученных от взрослых мышей. Это достигается путем извлечения неповрежденного мозга у взрослой мыши, которая была перфузирована с помощью транс-Карди специализированной искусственной спинномозговой жидкостью. Второй шаг заключается в подготовке срезов мозга из интересующей области мозга в нужной ориентации.

Затем отдельный срез мозга помещается в записывающую камеру под микроскопом, и отдельные нейроны внутри среза идентифицируются для записи. Заключительным этапом является запись всего клеточного зажима нейрона, за которой следует локальное применение препаратов для активации лиганд-зависимых ионных каналов с помощью второй стеклянной микропипетки. В конечном счете, этот метод изучения лиганд-зависимых ионных каналов используется для демонстрации биофизических свойств нативных рецепторов на живых нейронах.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как нанесение ванны или доставка лекарств на YouTube, заключается в том, что доставка лекарства к записанному нейрону происходит очень быстро и локализовано. Можно доставить небольшое количество лекарства и изучить несколько нейронов из одного среза. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, такие как определение нативных никотиновых рецепторов, участвующих в биофизических реакциях клетки, биологических и поведенческих реакциях на никотин.

В этой процедуре, после принесения в жертву взрослой мыши и получения мозга, обрезайте мозг в желаемой ориентации, чтобы включить интересующую область на охлажденной льдом металлической пластине. Затем прикрепите мозговой блок с помощью суперклея к поверхности сухой ступени вибрационного слайсера. Затем погрузите мозговой блок в раствор для восстановления NMDG на четыре градуса Цельсия и непрерывно пузырите раствор карбогеном.

Затем вырежьте срезы толщиной 250 микрон каждый из интересующей области мозга. Затем вытащите стандартную патчовую микропипетку с сопротивлением от четырех до шести мегаом, используя программируемый пуллер Flaming Brown. Наполните микропипетку подходящим раствором для внутриклеточной записи.

Затем перенесите срез в записывающую камеру на столик вертикального микроскопа, непрерывно проплавьте срез с газированным 32 градусом Цельсия стандартом записи A CSF со скоростью от 1,5 до 2,0 миллилитров в минуту. Под микроскопом найдите и центрируйте интересующую область мозга с помощью 10-кратного воздушного объектива. После этого визуализируйте отдельные нейроны с помощью 40-кратного объектива для погружения в воду в ближнем инфракрасном диапазоне, подключенного к инфракрасной дифференциальной интерференционной контрастной оптике, и высокоскоростного устройства с заряженной связью в ближнем инфракрасном диапазоне или видеокамеры CCD. При наблюдении ИК DIC здоровые нейроны демонстрируют гладкую светло-серую плазматическую мембрану после визуализации клеток.

Выполняйте запись всей клетки с помощью обычных методов. Теперь натяните еще один стандартный патч-зажим микропипетки, как и раньше, чтобы получить два идентичных сестринских наконечника из одного и того же куска стекла с оптимальным сопротивлением примерно пять мегаом. Заполните одну из микропипеток раствором препарата, разведенным в газированном стандартном пипетке, указав СМЖ кончиком вниз и проведите наполненной препаратом микропипеткой, чтобы удалить пузырьки воздуха, попавшие в микропипетку.

Затем установите наполненную лекарством микропипетку в держатель для пипетки, прикрепленный к микром манипулятору. Держатель для пипетки должен быть соединен трубкой с подходящей системой сброса давления. Вручную три-четыре раза нагнетайте давление в микропипетку, чтобы создать достаточное давление за столбом жидкости.

Затем опустите пипетку препарата в срез с помощью микром манипулятора с использованием I-R-D-I-C. Наблюдение. Расположите микропипетку препарата на поверхности среза ткани. Выполните один сброс давления и следите за тем, как рядом с наконечником перемещается мусор, связанный с выбросом и наконечником микропипетки.

При любых признаках того, что наконечник засорен или заблокирован, если наконечник забит, втяните пипетку и замените ее новой. Подойдите к записанной ячейке по диагонали от верха среза. Когда он находится в конечном положении, кончик пипетки, наполненной лекарственным средством, находится в той же фокальной плоскости, что и регистрируемая ячейка и кончик записывающего электрода, и находится на расстоянии от 10 до 40 микрон от регистрируемой клетки.

Если наконечник пипетки, заполненный лекарственным средством, находится над регистрируемой клеткой, сила выброса давления может нарушить гигагерное уплотнение клетки, а затем зарегистрировать ацетилхолин и/или никотин, вызванные клеточными токами, удерживая нейроны в режиме зажима напряжения. Несмотря на то, что подавление давления может быть инициировано вручную при использовании пико-распылителя три для получения более воспроизводимых результатов, рекомендуется запускать подавление давления с помощью системы сбора данных и цифрового импульса TTL. Чтобы улучшить эксперимент, держатель пипетки, наполненный лекарством, может быть установлен на одноразмерный пизоэлектрический транслятор, способный принимать аналоговый вход напряжения, который затем устанавливается на высокоточный микроманипулятор.

Пизоэлектрический транслятор полезен, потому что движение наполненной лекарством пипетки внутрь и из среза, включая время и скорость входа, можно легче контролировать и воспроизводить от эксперимента к эксперименту. Затем отрегулируйте напряжение до максимального значения с помощью потенциометра с ручным управлением на усилителе, управляемом электрическим напряжением. С помощью микроманипулятора поместите наполненную лекарством пипетку в срез.

Втяните пипетку, вручную снизив напряжение до нуля на усилителе, управляемом электрическим напряжением, с помощью аналогового выходного сигнала от записывающей системы сбора данных. Переместите наполненную препаратом пипетку в срез до того, как произойдет импульс TTL выброса давления. После того, как произойдет пульсация, втяните пипетку.

На этом рисунке показана репрезентативная реакция дофаминового нейрона на местное применение 100 микромолярного ацетилхолина, а на этой диаграмме показана репрезентативная реакция другого дофаминового нейрона на местное применение 100 микромолярного никотина. Вот потенциалы спонтанного действия дофаминового нейрона в срезе мозга мыши Alpha six L nine prime S, удерживаемом в режиме текущего зажима. Применение одного микромоля никотина с использованием 250-миллисекундного подавления индуцировало изменения в действии, потенциальной скорости возбуждения и мембранном потенциале покоя.

С помощью поиска пороговых значений в программном обеспечении P clamp была получена мгновенная скорость возбуждения для классификации нейронов по типам ацетилхолинового ответа отдельных верхних колусных нейронов. В срезе мозга мыши, содержащем Alpha six, L, девяти простых числах, был зажат напряжением с последующим локальным применением одного микромолярного никотина через выброс давления, нейроны первого типа демонстрировали повышенное IPC. После введения никотина нейроны второго типа демонстрировали большие внутренние токи и повышенное количество ЭПК в ответ на применение никотина.

Электрический переводчик Pizo обеспечивает однородность и защищает от утечки лекарств. Дофаминовый нейрон VTA в срезе мозга мыши Alpha six L 9 prime S был зарегистрирован в режиме хлопка по напряжению. Во время применения одного микромолярного никотина заполненная никотином пипетка перемещалась в конечное положение перед выбросом давления и убиралась после выброса с помощью пазоэлектрического транслятора.

Второй ответ был зарегистрирован через две минуты после первого, чтобы продемонстрировать, что десенсибилизации N-A-C-H-R не произошло. Эксперименты были повторены с применением 10 микромолярного никотина. Опять же, во втором ответе не наблюдалось десенсибилизации по сравнению с первым.

После освоения эта техника может быть выполнена всего за три часа, если все сделано правильно. В некоторых случаях от 10 до 15 нейронов могут быть изучены из одного среза мозга в течение одного дня. При попытке выполнить эту процедуру, важно помнить о точном расположении пипетки, наполненной лекарством, чтобы поддерживать баланс между полной активацией поверхностных никотиновых рецепторов и целостностью гига-уплотнения.