Капиллярная сила Литография для сердечной тканевой инженерии
June 10th, 2014
В этом протоколе мы демонстрируем изготовление биомиметических субстратов культуры сердечных клеток, изготовленных из двух различных полимерных материалов, с использованием капиллярной силовой литографии. Описанные методы обеспечивают масштабируемую, экономически эффективную технику для проектирования структуры и функции макроскопических тканей сердца для применения in vitro и in vivo.
Общая цель этой процедуры заключается в получении биомиметических субстратов клеточных культур для проектирования структуры и функции макроскопических тканей сердца. Это достигается путем предварительного изготовления силиконового мастера с желаемой топографической архитектурой методом глубокого реактивного ионного травления. Вторым шагом является перенос желаемого топографического рисунка с силиконового мастера на форму PUA с использованием капиллярной силовой литографии с помощью ультрафиолетового излучения.
Затем форма PUA используется в качестве шаблона для изготовления субстратов клеточных культур из различных полимерных материалов в зависимости от желаемого применения с помощью УФ-излучения или капиллярной силовой литографии, опосредованной растворителем. Заключительным этапом является нанесение либо первичных, либо полученных из стволовых клеток кардиомиоцитов на субстраты клеточной культуры наношаблона для последующего анализа. В конечном счете, светлая и иммунофлуоресцентная микроскопия используются для выявления изменений в морфологии клеток и договорном расположении белков в кардиомиоцитах.
Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как микроконтактная печать, заключается в том, что капиллярная силовая литография позволяет создавать субстраты клеточных культур с наноузорами, которые могут индуцировать структурное выравнивание монослоев сердечной ткани, не полагаясь на пролиферацию или миграцию клеток. Хотя этот метод может быть использован для получения представления о взаимосвязи структуры и функций сердечных тканей, он также может быть применен к другим системам, таким как механобиология рака. Чтобы изучить влияние топографии матрицы на миграцию клеток, начните эту процедуру с очистки мастер-поверхности кремния 100% этанолом или ксилолом и сушки в кислороде и газообразном азоте.
Затем поместите силиконовый шаблон стороной вверх в чашку Петри для кремниевого мастера с пипеткой размером два сантиметра на два сантиметра и два сантиметра 40 микролитров PUA. Затем поместите лист прозрачной полиэфирной пленки размером четыре сантиметра на четыре сантиметра поверх дозированного ПУА, придавите на лист ПЭТ и распределите ПУА под листом по всей поверхности шаблона с помощью валика или плоской кромки так, чтобы весь рисунок был покрыт предварительным полимером ПУА. Затем поместите силиконовый преполимер и ПЭТ примерно на 10 сантиметров ниже 20-ваттного ультрафиолетового света на 50 секунд.
После отверждения медленно снимите ПЭТ-пленку с помощью щипцов. PUA должен быть прикреплен к ПЭТ-пленке с негативом нанорисунка Silicon Master. Затем отверждайте наноузоры P-U-A-P-E-T под воздействием ультрафиолета в течение не менее 12 часов перед использованием.
Для очистки силиконовых мастеров поместите еще одну пленку ПЭТ поверх мастера без добавления ПУА. Подвергните его воздействию ультрафиолетового излучения в течение 50 секунд и снимите ПЭТ-пленку. Затем промойте силиконовый мастер 100% этанолом или ксилолом и высушите под газообразным кислородом азотом.
При этой процедуре обрабатывают круглые стеклянные предметные стекла диаметром 18 миллиметров, помещая их в озоновую камеру на 10 минут. Затем поместите слайды на блоки PDMS, чтобы временно закрепить их для удобства использования. Далее нанесите слой грунтовки для стекла на поверхность предметного стекла.
Дайте грунтовке высохнуть на воздухе в течение 30 минут. Теперь поместите стеклянные слайды на лист бумаги для принтера. Капните 10 микролитров полиуретанового предварительного полимера в центр каждого предметного стекла и убедитесь, что на нем не образуются пузырьки.
Затем поместите шаблон формы PUA лицевой стороной вниз на предметное стекло, равномерно диспергируйте предварительно полимер полиуретана по поверхности предметного стекла, прокатывая резиновый цилиндрический ролик вдоль формы PUA. Бумага для принтера впитает перелив полимера после того, как УФ-отверждение в течение 60 секунд под 20-ваттной УФ-лампой. Впоследствии, извлеките образец из источника ультрафиолетового излучения и осторожно очистите форму ПУА от стеклостекла с покрытием из ПУ Полимеризация ПУ считается завершенной.
Когда форма PUA чисто отклеится от образца и предметное стекло из полиуретана будет иметь радужный вид, поместите образцы в влагопоглотитель для хранения в течение месяца. Теперь приложите крышку NFS к 35-миллиметровой тканевой культуре полистирольной чашки пипеткой 20 микролитров NOA на дно чашки. Аккуратно положите защитный лист NPPU на верхнюю часть NOA и дайте клею разлиться и покройте все дно крышки, после чего отверните NOA, подвергая посуду воздействию ультрафиолета в течение 10 минут.
Затем простерилизуйте NP SUBSTRATA, дважды промыв его двумя миллилитрами 70% водного раствора этанола в течение пяти минут. Удалите этанол с помощью аспирации. Дайте A NFS полностью высохнуть на воздухе в течение примерно одного часа под ультрафиолетовой стерилизационной лампой в шкафу биологической безопасности.
Чтобы усилить клеточную адгезию, покройте A NFS фибронектином на ночь, сначала разбавив фибронектин в воде до пяти микрограммов на миллилитр. Далее пипеткой насыпьте в посуду два миллилитра раствора фибронектина. Затем поместите A NFS в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на ночь.
Получите NR VM, HESC CMS или другие интересующие сердечные клетки, центрифугируйте образец клеток при 1000 об/мин в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки. Осторожно удалите надосадочную жидкость путем аспирации и убедитесь, что она не потревожит гранулы. После этого ресуспендируют клетки в питательных средах до концентрации 4,6 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр.
Осторожно нанеситепипеткой 200 микролитров клеточной суспензии на стерилизованный A NFS и убедитесь, что клеточная суспензия остается на покровном стекле. Затем поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на четыре часа, чтобы позволить клеткам прикрепиться к A NFS. Затем добавьте в чашку два миллилитра дополнительной теплой питательной среды и снова поместите клетки в инкубатор в тех же условиях.
Через 24 часа удалите среду и дважды промойте двумя миллилитрами DPBS для удаления лишних клеток. После этого добавьте в посуду два миллилитра теплой питательной среды. Поместите клетки в инкубатор в одинаковых условиях и культуре.
Клетки к слиянию заменяют среды через день. На этом рисунке показаны репрезентативные изображения светлого поля виртуальных машин NR после семи дней культивирования и анализа изображений HESC. После 48 часов бактериологического исследования NR VM и HESC CMS на поверхностях NP демонстрируют очевидную структурную анизотропию и выравнивание, в то время как кардиомиоциты на поверхностях UN-паттерна ориентированы случайным образом.
Иммуногистохимический анализ подчеркивает влияние нанотопографии на выравнивание цитоскелета клеток, актиновые микрофиламенты и альфа-саркомерный актин в клетках, культивируемых на A NFS, выравниваются вдоль наногребней, но остаются случайно распределенными в клетках на неструктурированных субстратах. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о стерилизации субстрата перед посадкой в клетку, так как загрязнение может стать большой проблемой после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области сердечно-сосудистой биологии к изучению созревания сердца и кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток.
После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как получить субстраты биомиметической клеточной культуры с помощью капиллярной силовой литографии для приложений инженерии сердечной ткани.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол демонстрирует изготовление биоимитационных субстратов для культуры кардиомиоцитов с использованием литографии капиллярных сил. Описанные методы обеспечивают масштабируемый и экономичный подход к инженерии макроскопических кардиальных тканей для различных применений.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Инженерия кардиальных тканей
- Техники культуры клеток
- Полимерные материалы
Фон
- Биоимитационные субстраты необходимы для исследования кардиальных клеток.
- Литография капиллярных сил позволяет проводить точное формирование.
- Инженерия кардиальных тканей может улучшить in vitro и in vivo исследования.
- Использование различных полимерных материалов позволяет адаптировать применения.
Цель исследования
- Производство биоимитационных субстратов для культуры клеток.
- Инженерия структуры и функции кардиальных тканей.
- Содействие анализу поведения кардиомиоцитов.
Использованные методы
- Изготовление силиконового мастера с использованием глубокой реактивной ионной резки.
- Перенос топографических моделей на ПУА-форму с помощью литографии капиллярных сил с УФ-помощью.
- Изготовление субстратов для культуры клеток из различных полимерных материалов.
- Посадка кардиомиоцитов для анализа с использованием микроскопических методов.
Основные результаты
- Успешный перенос топографических моделей на субстраты для культуры клеток.
- Наблюдение изменений в морфологии клеток.
- Анализ контрактного расположения белков в кардиомиоцитах.
- Демонстрация эффективности биоимитационных субстратов.
Выводы
- Протокол обеспечивает надежный метод создания биоимитационных субстратов.
- Литография капиллярных сил является универсальной техникой для инженерии тканей.
- Дальнейшие исследования могут улучшить понимание поведения кардиальных клеток.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nanotopography effects on cardiomyocyte alignment and contractile protein organization.
- Operational Value: Provides cost-effective, scalable substrates for high-throughput assessment of matrix-mediated cellular responses.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating topographic variables in cardiac maturation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological and cytoskeletal readouts via brightfield and immunofluorescence microscopy.
- Operational Value: Delivers reproducible nanopatterned surfaces compatible with primary and stem cell-derived cardiomyocytes.
- Assay Readiness: Facilitates standardized evaluation of compound effects on tissue-level electromechanical coupling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges nanoscale ECM mimicry to functional tissue phenotypes relevant to disease modeling.
- Preclinical Utility: Enables risk-adjusted assessment of regenerative candidates using aligned cardiomyocyte monolayers.
- Mechanistic Insight: Clarifies structure-function relationships without confounding effects from cell proliferation or migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports functional target validation through controlled nanotopography-induced phenotypic modulation.
- Screening: Delivers standardized, alignment-inducing substrata for consistent compound screening in cardiac assays.
- Analytics: Provides quantitative imaging-based readouts for assessing cytoskeletal alignment and sarcomeric organization.
- Translational Research: Connects nanoscale substrate design to preclinical-relevant tissue maturation endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiovascular target validation across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue engineering by decoupling topographic cues from biochemical signals.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility via UV-assisted and solvent-mediated capillary force lithography processes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing predictive, human-relevant in vitro models.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement of cardiac regenerative candidates based on functional tissue metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, polymer chemistry, and cell culture techniques.
- Depends on UV curing equipment, precision molding tools, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and sterilization protocols across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to non-cardiac cell types or disease models.
- Limited by the need for specialized masters and molds, though scalable via replication.
