Капиллярная сила Литография для сердечной тканевой инженерии

Общая цель этой процедуры заключается в получении биомиметических субстратов клеточных культур для проектирования структуры и функции макроскопических тканей сердца. Это достигается путем предварительного изготовления силиконового мастера с желаемой топографической архитектурой методом глубокого реактивного ионного травления. Вторым шагом является перенос желаемого топографического рисунка с силиконового мастера на форму PUA с использованием капиллярной силовой литографии с помощью ультрафиолетового излучения.

Затем форма PUA используется в качестве шаблона для изготовления субстратов клеточных культур из различных полимерных материалов в зависимости от желаемого применения с помощью УФ-излучения или капиллярной силовой литографии, опосредованной растворителем. Заключительным этапом является нанесение либо первичных, либо полученных из стволовых клеток кардиомиоцитов на субстраты клеточной культуры наношаблона для последующего анализа. В конечном счете, светлая и иммунофлуоресцентная микроскопия используются для выявления изменений в морфологии клеток и договорном расположении белков в кардиомиоцитах.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как микроконтактная печать, заключается в том, что капиллярная силовая литография позволяет создавать субстраты клеточных культур с наноузорами, которые могут индуцировать структурное выравнивание монослоев сердечной ткани, не полагаясь на пролиферацию или миграцию клеток. Хотя этот метод может быть использован для получения представления о взаимосвязи структуры и функций сердечных тканей, он также может быть применен к другим системам, таким как механобиология рака. Чтобы изучить влияние топографии матрицы на миграцию клеток, начните эту процедуру с очистки мастер-поверхности кремния 100% этанолом или ксилолом и сушки в кислороде и газообразном азоте.

Затем поместите силиконовый шаблон стороной вверх в чашку Петри для кремниевого мастера с пипеткой размером два сантиметра на два сантиметра и два сантиметра 40 микролитров PUA. Затем поместите лист прозрачной полиэфирной пленки размером четыре сантиметра на четыре сантиметра поверх дозированного ПУА, придавите на лист ПЭТ и распределите ПУА под листом по всей поверхности шаблона с помощью валика или плоской кромки так, чтобы весь рисунок был покрыт предварительным полимером ПУА. Затем поместите силиконовый преполимер и ПЭТ примерно на 10 сантиметров ниже 20-ваттного ультрафиолетового света на 50 секунд.

После отверждения медленно снимите ПЭТ-пленку с помощью щипцов. PUA должен быть прикреплен к ПЭТ-пленке с негативом нанорисунка Silicon Master. Затем отверждайте наноузоры P-U-A-P-E-T под воздействием ультрафиолета в течение не менее 12 часов перед использованием.

Для очистки силиконовых мастеров поместите еще одну пленку ПЭТ поверх мастера без добавления ПУА. Подвергните его воздействию ультрафиолетового излучения в течение 50 секунд и снимите ПЭТ-пленку. Затем промойте силиконовый мастер 100% этанолом или ксилолом и высушите под газообразным кислородом азотом.

При этой процедуре обрабатывают круглые стеклянные предметные стекла диаметром 18 миллиметров, помещая их в озоновую камеру на 10 минут. Затем поместите слайды на блоки PDMS, чтобы временно закрепить их для удобства использования. Далее нанесите слой грунтовки для стекла на поверхность предметного стекла.

Дайте грунтовке высохнуть на воздухе в течение 30 минут. Теперь поместите стеклянные слайды на лист бумаги для принтера. Капните 10 микролитров полиуретанового предварительного полимера в центр каждого предметного стекла и убедитесь, что на нем не образуются пузырьки.

Затем поместите шаблон формы PUA лицевой стороной вниз на предметное стекло, равномерно диспергируйте предварительно полимер полиуретана по поверхности предметного стекла, прокатывая резиновый цилиндрический ролик вдоль формы PUA. Бумага для принтера впитает перелив полимера после того, как УФ-отверждение в течение 60 секунд под 20-ваттной УФ-лампой. Впоследствии, извлеките образец из источника ультрафиолетового излучения и осторожно очистите форму ПУА от стеклостекла с покрытием из ПУ Полимеризация ПУ считается завершенной.

Когда форма PUA чисто отклеится от образца и предметное стекло из полиуретана будет иметь радужный вид, поместите образцы в влагопоглотитель для хранения в течение месяца. Теперь приложите крышку NFS к 35-миллиметровой тканевой культуре полистирольной чашки пипеткой 20 микролитров NOA на дно чашки. Аккуратно положите защитный лист NPPU на верхнюю часть NOA и дайте клею разлиться и покройте все дно крышки, после чего отверните NOA, подвергая посуду воздействию ультрафиолета в течение 10 минут.

Затем простерилизуйте NP SUBSTRATA, дважды промыв его двумя миллилитрами 70% водного раствора этанола в течение пяти минут. Удалите этанол с помощью аспирации. Дайте A NFS полностью высохнуть на воздухе в течение примерно одного часа под ультрафиолетовой стерилизационной лампой в шкафу биологической безопасности.

Чтобы усилить клеточную адгезию, покройте A NFS фибронектином на ночь, сначала разбавив фибронектин в воде до пяти микрограммов на миллилитр. Далее пипеткой насыпьте в посуду два миллилитра раствора фибронектина. Затем поместите A NFS в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на ночь.

Получите NR VM, HESC CMS или другие интересующие сердечные клетки, центрифугируйте образец клеток при 1000 об/мин в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки. Осторожно удалите надосадочную жидкость путем аспирации и убедитесь, что она не потревожит гранулы. После этого ресуспендируют клетки в питательных средах до концентрации 4,6 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр.

пипеткой 200 микролитров клеточной суспензии на стерилизованный A NFS и убедитесь, что клеточная суспензия остается на покровном стекле. Затем поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на четыре часа, чтобы позволить клеткам прикрепиться к A NFS. Затем добавьте в чашку два миллилитра дополнительной теплой питательной среды и снова поместите клетки в инкубатор в тех же условиях.

Через 24 часа удалите среду и дважды промойте двумя миллилитрами DPBS для удаления лишних клеток. После этого добавьте в посуду два миллилитра теплой питательной среды. Поместите клетки в инкубатор в одинаковых условиях и культуре.

Клетки к слиянию заменяют среды через день. На этом рисунке показаны репрезентативные изображения светлого поля виртуальных машин NR после семи дней культивирования и анализа изображений HESC. После 48 часов бактериологического исследования NR VM и HESC CMS на поверхностях NP демонстрируют очевидную структурную анизотропию и выравнивание, в то время как кардиомиоциты на поверхностях UN-паттерна ориентированы случайным образом.

Иммуногистохимический анализ подчеркивает влияние нанотопографии на выравнивание цитоскелета клеток, актиновые микрофиламенты и альфа-саркомерный актин в клетках, культивируемых на A NFS, выравниваются вдоль наногребней, но остаются случайно распределенными в клетках на неструктурированных субстратах. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о стерилизации субстрата перед посадкой в клетку, так как загрязнение может стать большой проблемой после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области сердечно-сосудистой биологии к изучению созревания сердца и кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как получить субстраты биомиметической клеточной культуры с помощью капиллярной силовой литографии для приложений инженерии сердечной ткани.