Одиночных молекул изображений регуляции генов В естественных условиях Использование Cotranslational активацию путем расщепления (CoTrAC)

Целью этой процедуры является получение покадровых флуоресцентных изображений растущих колоний кишечной палочки, экспрессирующих ко-трековые конструкции для идентификации количества вновь образующихся белковых молекул. Это достигается путем предварительной подготовки образца клеток, coex, экспрессирующего представляющий интерес белок, слитый с флуоресцентным репортером Cora, и протеазы, которая специфически расщепляется между репортером Cora и интересующим белком. Вторым этапом является приготовление геля низкой температуры плавления Aris с использованием М девяти минимальных сред.

Затем подготавливается гелевая подушка AROS для использования с камерой образца с регулируемой температурой. Клетки кишечной палочки помещаются на гель и камера собирается. Последний шаг заключается в том, чтобы поместить камеру на флуоресцентный микроскоп и получить изображение нескольких растущих колоний клеток через равные промежутки времени в течение нескольких поколений.

Фотообесцвечивание вновь полученных молекул отчета TRE на каждом интервале всех конечных ре используется для получения временных следов производства белка в живых клетках с разрешением одной молекулы и одной клетки. Преимущество этого метода по сравнению с измерениями отдельных клеток с использованием флуоресцентного слияния белков заключается в том, что производство любого рака белковых молекул может быть прослежено с помощью процедуры с одной молекулой, и результат влияет на функции этих молекул. Сконструировать последовательности вставок штаммов, кодирующих последовательность локализации мембраны, быстро созревающий флуоресцентный белок, а также последовательность узнавания протеазы и концевую в кадре с белком, представляющим интерес в данном конкретном случае, фактором транскрипции или tf.

В этой процедуре использовался мембранный таргетированный венозный репортер TSR. Репортер был слит с последовательностью распознавания протеазы убиквитином для подсчета количества экспрессированных бактериями фага лямбда-репрессора, С-1 белковых молекул. После включения конструкции в хромосому кишечной палочки плазмида, кодирующая протеазу, специфичную для узнавающей последовательности, преобразуется в штамм, экспрессирующий флуоресцентный репортер и белок, представляющие интерес в трансляционном слиянии.

В этом протоколе используется протеаза убиквитин карбокси Hydro one, которая расщепляется сразу после утилизации С-концевого остатка убиквитина. Чтобы начать этот протокол, выберите одну колонию кишечной палочки из только что прожаренной агаровой пластины в один миллилитр М девять, минимальную среду, дополненную одной минимальной незаменимой средой аминокислот и соответствующими антибиотиками. Инкубация шейкера при желаемой температуре достаточна для достижения оптической плотности на 600 нанометров или наружного диаметра 600 больше 1,0.

Затем разведите культуру в одном миллилитре свежей среды М 9 с соответствующими антибиотиками до наружного диаметра 600 0,02. Инкубируя шейкер при соответствующей температуре, первоначальная клеточная плотность может быть увеличена, если это необходимо для роста при низких температурах. Когда наружный диаметр 600 будет равен 0,2-0,3, начните подготовку гелевой прокладки ARO, взвесив от 10 до 20 миллиграммов низкой температуры плавления в микропробирку объемом 1,5 миллилитров.

Добавьте соответствующий объем М девять, минимальную среду без антибиотиков, чтобы получился 3%-ный раствор. Затем нагрейте возникший раствор в течение 30 минут при температуре 70 градусов Цельсия до полного плавления. Переверните трубку, чтобы убедиться, что раствор полностью расплавился и стал однородным.

Для сборки гелевой подушечки промойте одно предварительно очищенное защитное стекло и одну горку микроводопровода стерильной водой. Высушите покровное стекло и сдвиньте путем обдува сжатым воздухом. Поместите резиновую прокладку на ползунок микроводопровода так, чтобы она закрывала входные и выходные отверстия.

На стеклянную сторону предметного стекла нанесите 50 микролитров раствора ARO на центр микроводопровода. Сдвиньте сверху раствор ARO с очищенным сухим покровным стеклом. Дайте агрораствору настояться при комнатной температуре в течение 30 минут.

Когда клетки достигают OD 600 от 0,3 до 0,4, они готовы к визуализации. Перелейте один миллилитр инкубированной культуры в микроцентрифугу объемом 1,5 мл при 10 000 G в течение одной минуты в настольной микроцентрифуге. Выбросив средство SUP, добавьте один миллилитр свежей среды M nine и восстановите.

Суспензию гранул осторожно центрифугируйте снова при 10 000 G в течение одной минуты. Затем повторите этап центрифугирования еще раз, аккуратно ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре среды М девять. На этом этапе клетки можно использовать для визуализации под микроскопом или разбавлять в 10–100 раз, чтобы обеспечить низкую плотность клеток для покадровой визуализации.

Чтобы подготовить образец для визуализации, осторожно снимите покровное стекло с верхней части гелевой подушечки. Добавьте один микролитр промытой клеточной культуры в верхнюю часть гелевой подушечки. Подождите примерно две минуты, пока культура впитается гелевой подушечкой.

Важно не ждать так долго, чтобы гелевая подушечка высохла. Идеальное время будет варьироваться в зависимости от температуры и влажности во время ожидания высыхания. Еще одно предварительно очищенное покровное стекло.

После того, как образец высохнет, накройте образец новым покровным стеклом, убедившись, что покровное стекло и предметное стекло микроводопровода хорошо выровнены. Соберите камеру выращивания с регулируемой температурой, следуя инструкциям производителя. Теперь его можно использовать для получения изображений под микроскопом.

Чтобы начать визуализацию, включите лазер и микроскоп, следуя инструкциям производителя. Зафиксируйте собранную камеру на предметной вставке на микроскопе. Установите температуру камеры роста и обогревателя объектива на уровне 37 градусов Цельсия или другой желаемой температуры роста.

При визуализации выше комнатной температуры фокус или гелевая прокладка обычно будет значительно дрейфовать в течение примерно 15 минут после первоначального сдвига температуры. На практике. Используйте это время для поиска областей интереса и изменения сценариев обработки изображений по мере необходимости.

Для эксперимента. Отрегулируйте интенсивность лазерного возбуждения таким образом, чтобы почти все флуоресцентные молекулы фотообесцвечивались в течение шести экспозиций. Найдите клетки на микроскопе и центрируйте их в заранее определенной и выровненной области визуализации.

Затем сохраните положение каждой ячейки, более одной ячейки может быть изображено на каждом изображении. Временное окно получения данных для покадровой визуализации в течение многих поколений гарантирует, что клетки изображения изначально отделены от других клеток, но по крайней мере на несколько сотен микрон, чтобы другие колонии не попали в область визуализации во время роста. С помощью автоматизированного сценария обработки изображений можно получить покадровые данные с помощью алгоритма, описанного в этом экспериментальном рабочем процессе, который можно найти в текстовом протоколе, прилагаемом к этому видео.

На этих изображениях показаны типичные данные покадровой съемки из эксперимента с отслеживанием кода. Изображения из одной колонии демонстрируются с интервалом в 25 минут. В этом эксперименте каждые пять минут собирались данные из 12 различных колоний.

Эти изображения представляют собой светлопольные изображения и флуоресцентные изображения Венеры YFP с вычитанием среднего фона для учета изменения фона всего поля изображения. Со временем, когда изображения накладываются друг на друга, они выявляют локализацию полюсов венозных молекул репортера TSR и гетерогенность в количестве молекул, производимых в пятиминутных временных окнах в разных клетках. Здесь показаны типичные данные из одного временного момента в эксперименте с кодовым треком: венозные флуоресцентные изображения шести 100-миллисекундных экспозиций, которые были получены в начале каждого пятиминутного временного интервала.

Каждая из шести экспозиций была разделена на 900 миллисекунд, чтобы дать время для временно темных молекул вен, которые мигали, чтобы стать флуоресцентными для анализа. Изображение шесть вычитается из изображения 1 для коррекции неотбеленных молекул и автофлуоресценции. Фоновые пятна на этом изображении локализованы по конкретным клеточным линиям и количественно оцениваются по их интегральной интенсивности флуоресценции.

Затем средняя интегральная флуоресценция колонии строится на шести изображениях, подгоняя эту линию под экспоненциальный затухание. Кроме того, постоянное смещение дает полувремя затухания примерно в одну секунду. В этом эксперименте венозные молекулы фотоотбеливаются гораздо быстрее, чем клеточная автофлуоресценция.

Таким образом, примерно половина от общего числа венозных молекул подвергается фотообесцвечиванию в каждом кадре. Для этой процедуры может быть выполнен анализ визуализации проводимости, чтобы получить три измерения количества белковых молекул, производимых в отдельных клетках.